Publicación Cuatrimestral. Vol. 3, Año 2018, N
o
1 (1-24).
DESARROLLO DE UN MÉTODO PARA LA ESPECIACIÓN DE
SELENIO EN MUESTRAS DE CERVEZA
MSc. Jenifer Smith
1
, Dra. Marinela Colina
1,2*
, Dr. Gilberto Colina
3
y Lic. Brinolfo
Montilla
1
1
Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias Departamento de Química, Maracaibo 4011,
Zulia, Venezuela.
2
Innovación Ambiental Quitosano CA, San Francisco No 29-25, Maracaibo, Zulia, VENEZUELA
3
Laboratorio de Ingeniería Sanitaria y Ambiental DISA. Facultad de Ingeniería. Universidad del Zulia.
Maracaibo. Venezuela.
*Autor para la correspondencia. E-mail: colinamarinela@gmail.com
Recibido: 6-12-2017 / Aceptado: 26-3-2018
RESUMEN
Se desarrolló un método por cromatografía iónica (CI) para la especiación de selenio en muestras líquidas de
cerveza, empleando H
2
O
2
y luz UV como sistema oxidante. Las especies aniónicas de selenio fueron
separadas utilizando una columna aniónica AS4A y un guarda columna AG4 Dionex, la fase móvil empleada
fue de 1,7 mM NaHCO
3
/1,8 mMNa
2
CO
3
, para la cuantificación se empleó un detector de conductividad iónica.
El tiempo de retención del ión Se(IV) fue de 7,8 min y para Se(VI) de 15,7 min. Los límites de detección
obtenidos para Se(IV) y Se(VI) fueron de 0,15 y 0,28 mgL
-1
, respectivamente. Se establecieron las condiciones
óptimas de análisis del proceso de oxidación de los compuestos puros de selenio: selenito y selenio-DL-
metionina, mediante el estudio de diferentes parámetros como cantidad de peróxido adicionado, tiempo de
digestión y pH. La separación de los iones Se(IV) y Se(VI) en muestras de cerveza se realizó empleando una
fase móvil de 2,0 mM de carbonato de sodio y 1,0 mM de hidróxido de sodio, ésta mezcla separa los iones
de selenio sin tener problemas de interferencias de nitrato, fosfato y sulfato. Los límites de detección
determinados para Se(IV) y Se(VI) fueron 0,08 y 0,07 mgL
-1
, respectivamente. El método desarrollado se
comparó con un método referencial ICP AES, obteniéndose excelentes resultados.
Palabras clave: Especiación, selenio, cerveza, cromatografía iónica.
DEVELOPMENT OF A METHOD FOR THE SPECIATION OF
SELENIO IN BEER SAMPLES
ABSTRACT
A method was developed by ion chromatography (IC) for the speciation of selenium in liquid samples of beer,
using H
2
O
2
and UV light as an oxidant system. The anionic selenium species were separated using an anionic
column AS4A and a guard column AG4 Dionex, the mobile phase used was 1.7 mM NaHCO
3
/1.8 mM Na
2
CO
3
,
for the quantification an ionic conductivity detector was used. The retention time of the Se(IV) ion was 7.8 min
and for Se(VI) was 15.7 min. The detection limits obtained for Se(IV) and Se(VI) were 0.15 and 0.28 mgL
-1
,
respectively. The optimal conditions of oxidation process analysis of the selenium pure compounds: selenite
and selenium-DL-methionine were established, with the study of different parameters such as amount of
peroxide added, time of digestion and pH. The separation of the Se(IV) and Se(VI) ions in beer samples was
carried out using a mobile phase of 2.0 mM sodium carbonate and 1.0 mM sodium hydroxide, this mixture
separates the selenium ions without interference problems of nitrate, phosphate and sulfate. The detection
Ciencias
Químicas
Artículo de Investigación
MSc. Jenifer Smith et al.
2
limits determined for Se(IV) and Se(VI) were 0.08 and 0.07 mg L
-1
, respectively. All developed was compared
with a reference method ICP AES, obtaining excellent results.
Key words: Speciation, selenium, beer, ionic chromatograph.
DESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO PARA A ESPECIAÇÃO
DO SELENIO EM AMOSTRAS DE CERVEJA
RESUMO
Um método foi desenvolvido por cromatografia iônica (CI) para a especiação de selênio em amostras líquidas
de cerveja, usando H
2
O
2
e luz UV como um sistema oxidante. espécies de selénio aniónicos foram separados
utilizando uma coluna aniônica AS4A e pré-coluna Dionex AG4, a fase móvel utilizada esteve constituida de
1,7 mM de NaHCO
3
/1,8 mM Na
2
CO
3
enquanto um detector de condutividade iónica para quantificação foi
utilizado. O tempo de retenção do íon Se(IV) foi de 7,8 min e para Se(VI) de 15,7 min. Os limites de detecção
obtidos para Se(IV) e Se(VI) foram de 0,15 e 0,28 mg L
-1
, respectivamente. Foram estabelecidas as condições
ótimas de análise do processo de oxidação de compostos de selénio puros: selenito e metionina selênio-DL-
, através do estudo de diversos parâmetros, como a quantidade de peróxido adicionado, e a digestão pH
tempo. A separação dos íonse Se(IV) e Se(VI) nas amostras de cerveja forami realizadas utilizando uma fase
móvel de carbonato de sódio 2,0 mM e hidróxido de sódio 1,0 mM, esta mistura separa os íons de selénio
sem problemas de interferência de nitrato, fosfato e sulfato. Os limites de detecção determinados para Se(IV)
e Se(VI) foram 0,08 e 0,07 mg L
-1
, respectivamente. O método desenvolvido foi comparado com um método
de referência ICP AES, obtendo excelentes resultados.
Key words: Especiação, selênio, cerveja, cromatografia iônica.
1. INTRODUCCIÓN
El selenio es un elemento esencial para el organismo humano, debido a sus funciones
atribuidas en los procesos biológicos, encontrándose en diversas formas orgánicas
(Rodriguez, Sanz & Diaz, 2009). En el ambiente, este elemento se encuentra en una
variedad de compuestos inorgánicos, existiendo en diferentes estados de oxidación (-2, 0,
+4, +6). El selenito (Se(IV)) y el selenato (Se(VI)), dos formas oxidadas del selenio
(oxianiones), presentan una elevada solubilidad en agua y sus compuestos son muy
estables, sin embargo, el Se(IV) es más tóxico que el Se(VI) (Hatfield, Schweizer, Tsuji,
Gladyshev, 2016).
El selenio en forma elemental es insoluble en agua y no es tóxico en condiciones normales,
el selenuro de hidrógeno (H
2
Se) es un gas altamente tóxico, pero se oxida rápidamente a
selenio elemental en presencia del aíre (Townshend, 1995).
La levadura de cerveza y el gérmen de trigo son ricas fuentes de selenio y son considerados
“alimentos sanos”. De igual forma este elemento se traslada en las aguas de drenaje
agrícola y en aguas naturales, en el régimen de concentraciones de miligramos por litros, y
de allí ingresa a la cadena alimenticia (Zárate, Lundquist, Brent & Bailey, 1998). Entre los
métodos analíticos para la determinación de selenio total se encuentran: la
Desarrollo de un Método para la Especiación de Selenio en Muestras de Cerveza
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 3
espectrofluorimetría (Cáceres & Gardiner, 2000), la espectrometría de absorción atómica
con generación de hidruros (HG-AAS) (Johansson, Bordin & Rodríguez, 2000; Ipolyi,
Stefánka & Fodor, 2001; Frankenberger, Zhang & Moore, 1999), la espectroscopía de
emisión atómica con plasma inductivamente acoplado (ICP-AES) (Bou, Guardiola, Padró,
Pelfort & Codony, 2004; Machat, Otruba & Kanicky, 2002), los cuales han sido
frecuentemente empleados para su análisis elemental en laboratorios. La espectrometría
de masas con plasma inductivamente acoplado (ICP-MS) (Larsen & Sloth, 2000; Larsen,
Sloth, Bügel & Moesgaard, 2003; Caruso, Ponce de León, De Nicola & Montes, 2003), es
una técnica empleada para la cuantificación de selenio en muestras ambientales,
ofreciendo bajos límites de detección. Sin embargo, debido al alto costo y a la poca
disponibilidad de estos equipos, es necesario la determinación de éste elemento utilizando
otras técnicas.
La determinación de selenio en muestras ambientales usualmente requiere la digestión de
la matriz de la muestra, dado que ocurre la transformación de todas las especies de selenio
a formas inorgánicas, usando un procedimiento de digestión con oxidantes tradicionales,
formándose de esta forma dos oxianiones de selenio (Se(IV) y Se(VI)). Sin embargo,
cuando se requiere cuantificar la cantidad total de este elemento en la muestra, el selenato
puede ser producido al emplear una digestión con oxidantes fuertes, como; ozono (O
3
),
dicromato de potasio (K
2
Cr
2
O7), peroxodisulfato de potasio (K
2
S
2
O
8
), como también ácido
nítrico (HNO
3
), la mezcla de H
2
O
2
/H
2
SO
4
o peróxido de hidrógeno (H
2
O
2
), entre otros.
Mientras que el Se(IV) se puede obtener por reducción con el empleo de un ácido (Wang,
Gao & Belzile, 2001).
La levadura de cerveza es un hongo constituido por el género Saccharomyces Cerevisiae,
se consume seca y se utiliza como organismo responsable para la fermentación y es un
valioso alimento para el ser humano. Está considerada como el cultivo más antiguo
realizado por el hombre y el comienzo de la biotecnología (Mejía-Barajas, Montoya-Pérez,
Cortés-Rojo & Saavedra-Molina, 2016). Presenta concentraciones de selenio alrededor de
0,13 μg g
–1
(Lobinski, McSheehy, Pannier, Szpunar & Potin-Gautier, 2002). Además, cerca
de treinta compuestos diferentes de selenio se encuentran en los extractos acuosos de
levaduras.
La selenometionína es la especie química predominante en levaduras. Frecuentemente se
usa como fuente de algunos suplementos nutricionales, éste compuesto muestra menos
toxicidad que las especies inorgánicas de selenio, además que se encuentra en la mayoría
de las plantas. Por esta razón, se han reportados métodos sensibles y selectivos para la
determinación de éste compuesto en diferentes matrices (Guyon, Pradeau, Robinet & Do,
MSc. Jenifer Smith et al.
4
2001; Rosen, Hartman, Ho, Hiserodt & Tsai, 1998; Chatterjee, Shibata & Morita, 2000). La
selenocisteina es otra forma orgánica del selenio de importancia, ya que se encuentra en
las proteínas de los humanos y animales.
Existen diferentes técnicas analíticas para la separación y determinación de especies
iónicas de selenio, pero la cromatografía iónica ha introducido un amplio campo de
aplicación a muestras con diferentes intervalos de concentraciones (Gammelgaard & Jøns,
2000; Niss, Schabron & Brown, 1993; Tirez, Brusten, Van, De Brucber & Diles, 2000). Este
hecho ha conducido hasta ahora a convenientes avances, tanto en la sensibilidad, así como
en la selectividad de detección para el análisis de muestras ambientales. Además, que el
empleo de una columna supresora ha sido reconocido para la determinación de aniones en
aguas naturales (Cole & Evrovski, 1997). El Se(IV) y el Se(VI) son las especies inorgánicas
predominantes en aguas naturales y en extractos húmedos, presentando una
concentración que varía entre 0,1 a 400 μg L
–1
(Sanz & Conde, 1997; Yan, Lu, Zhang,
Wang, & Liu, 2004)). Sin embargo, recientes estudios han demostrado la existencia de
selenocianato (SeCN
–
) en aguas residuales industriales (Wallschläger & Bloom, 2001). Sin
embargo, el agua escasa en sólidos selenoférricos en áreas semiáridas pueden contener a
unos cientos o miles de microgramos disueltos de selenio por litro (Clesceri, Greenberg &
Rhodes, 1989).
Cromatografía iónica
La cromatografía iónica (CI) (Sarzanini, Mentasti & Bruzzoniti, 1998) se basa en la
separación y cuantificación de iones, por medio de su distribución de equilibrios entre dos
fases inmiscibles; una fase estacionaria y otra móvil. La fase estacionaria contiene grupos
funcionales iónicos y retiene el soluto, de características iónicas pero de signo opuesto,
intercambiándolo por un proceso reversible con iones de la fase móvil. La separación de
los componentes de la muestra es basada en la carga y tamaño de los iones (Skoog, Holler
& Nieman, 2001). La composición de la fase móvil proporciona una gran flexibilidad para la
manipulación del analito retenido, ya que se logra una deseada separación y optimización
del análisis (Janos, 1997).
Colina & Gardiner (1999), estudiaron la oxidación de azufre, fósforo y nitrógeno usando
microondas para la digestión con peróxido de hidrógeno (Wilson, 1994; Craig, 1999),
activado con ácido fórmico y determinando los iones sulfato, fosfato y nitrato
correspondientes por cromatografía iónica. La cromatografía iónica (Goyal, 1997). puede
ser aplicada para muestras de un amplio rango de especies iónicas de interés ambiental y
de elevadas trazas de concentraciones, debido al especial progreso que ha presentado en
las técnicas de detección (Buchberger & Haddad, 1997; Woods & Rowland, 1997). Sin
Desarrollo de un Método para la Especiación de Selenio en Muestras de Cerveza
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 5
embargo, el uso de HG-AAS (Camara, Perez & Moreno, 2000) y ICP-MS han sido las
técnicas más empleadas para el análisis de muestras líquidas (biológicas y ambientales).
En este trabajo, se desarrolló un método para la determinación y especiación de selenio en
muestras de cerveza utilizando cromatografía iónica y digestión con peróxido de hidrógeno.
2. PARTE EXPERIMENTAL
2.1. Materiales y reactivos
En el desarrollo del método para la especiación de selenio por cromatografía iónica se
empleó peróxido de hidrógeno con luz ultravioleta y se utilizaron los siguientes reactivos:
Estándar certificado de selenio (Aldrich, 980 μg mL
–1
de Se en 1% de HNO
3
), Selenito de
sodio (Na
2
SeO
3
) y selenato de sodio (Na
2
SeO
4
) (AnalaR BDH), Seleno–DL-Metionina
(C
5
H
11
O
2
NSe) (MP Biomedicals), Sulfato de sodio (Merck, 99% de pureza) y sulfito de sodio
(J.T. Baker Analyzed, 99% de pureza), Nitrato de sodio (Merck, 99,9% de pureza) y nitrito
de sodio (J.T. Baker Analyzed, 99% de pureza). Cloruro de sodio (Merck, 99,5% de pureza),
Peróxido de hidrógeno al 30% v/v (Merck), Ácido clorhídrico 37% (Fisher Scientific
Company), Ácido orto-fosfórico 85% (Riedel-deHaën), Hidróxido de sodio (Baker Analyzed,
99% de pureza), Ácido nítrico 65% (Riedel-deHaën), Carbonato de sodio (Merck, 99,9% de
pureza) y carbonato ácido de sodio (Riedel-deHaën 99,7%), Agua destilada y desionizada,
Material volumétrico de plástico y vidrio, Bombas de alta presión del tipo Parr N º4745 con
envases de politretrafluoruro de etileno (PTFE).
2.2. Equipos
Cromatógrafo iónico marca Dionex; modelo LC20, equipado con una bomba cuaternaria;
modelo GP40, una columna aniónica Ion Pac AS4A Dionex (4x250 mm), un guarda columna
aniónica Ion Pac AG4A Dionex (4x50 mm), con un sistema de supresión Dionex ASRS–
Ultra 11 (4mm) y detector de conductividad modelo CD20. Interfase marca Hewlett Packard,
modelo 35900E para el análisis de los datos se utilizó el software HP Chem. En la Tabla 1
se muestran las condiciones operacionales empleadas por el cromatógrafo iónico para la
determinación de los iones Se(IV) y Se(VI). Espectrofotómetro de emisión atómica con
plasma inductivamente acoplado (ICP-AES) marca Perkin Elmer; modelo óptima 2000DV.
En la Tabla 2 se muestran los parámetros operacionales usados en ICP-AES para la
determinación de selenio total. Una lámpara de vapor de mercurio a baja presión con una
potencia de 400 watts, marca UVP modelo TMW–20 Transiluminador UV-VIS para la
MSc. Jenifer Smith et al.
6
digestión vía UV. Potenciómetro marca WPA CD500 para medición de pH. Sonicador marca
Branson modelo 2210 para la homogenización de la muestra.
Tabla 1. Condiciones operacionales empleadas en
Cromatografía Iónica (CI) para la determinación de los
iones Se(IV) y Se(VI).
Tabla 2. Parámetros operacionales usados en
espectrometría de emisión atómica con plasma
inductivamente acoplado (ICP-AES) para la
determinación de selenio.
Condiciones
Datos
Datos
Fase Móvil
1,8 mM Na
2
CO
3
/1,7 mM
NaHCO
3
196,06nm – 203,985 nm
Velocidad de flujo
1 mL min
–1
Argón
Sensibilidad del
detector
50 S
15 mL min
–1
Volumen de muestra
50 L
0,2 mL min
–1
Solución regenerante
Agua desionizada
0,8 mL min
–1
2
2.3. Procedimiento experimental
2.3.1. Preparación de las soluciones de selenio
Los compuestos puros de selenio empleados para establecer las condiciones
experimentales óptimas para el proceso de digestión, selenito y selenato de sodio se
calentaron en una estufa durante 4 horas a 110 °C y luego fueron colocados en un
desecador por 48 horas para eliminar la posible humedad existente, y posteriormente fueron
pesados. Se prepararon soluciones de trabajo de 1000 mg L
–1
(332,978 mg) de selenio a
partir de selenito de sodio y 25 mg L
–1
(6,2056 mg) de solución de selenio a partir de seleno–
DL-metionina. La solución de selenito de sodio se preparó diariamente para evitar que el
contenido de selenito presente se oxidara a selenato, mientras que la solución concentrada
de seleno–DL-metionina fue guardada en envase plástico y refrigeradas a 4°C.
2.3.2. Optimización de las condiciones cromatográficas
La fase móvil empleada consiste en una mezcla buffer de carbonato de sodio y bicarbonato
de sodio 1,8 mM y 1,7 mM respectivamente, en agua desionizada. La fase móvil fue filtrada
a través de filtros de éster de celulosa por un tiempo de 15 min antes de ser utilizados para
el análisis cromatográfico. Se utilizó un flujo de 1 mL min
–1
en todos los análisis
cromatográficos, el cual proporcionó una buena selectividad y resolución en la separación
Desarrollo de un Método para la Especiación de Selenio en Muestras de Cerveza
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 7
cromatográfica. Todas las soluciones de trabajo fueron filtradas a través de un filtro de
jeringa de 0,2 μM de PTFE antes de la inyección en el cromatógrafo iónico.
2.3.3. Sistema de calibración
Se prepararon soluciones estándares de 0,1;0,5; 1,0; 3,0; 5,0; 7,5 y 10,0 mg L
–1
de Se(IV)
y Se(VI), respectivamente; a partir de una solución de trabajo de 1000 mg L
–1
. Cada
solución estándar se evaluó por triplicado y el tiempo de análisis empleado para el ión
Se(IV) fue de 9 min y para el Se(VI) fue de 17,0 min. El sistema de calibración se realizó
diariamente con soluciones estándares preparadas (0,5; 1,0 y 3,0 mg L
–1
de Se(VI)), para
asegurar parámetros instrumentales constantes.
2.3.4. Procedimientos de digestión
Se establecieron las condiciones óptimas del análisis para la digestión de los compuestos
puros de selenio empleando, como sistema oxidante, peróxido de hidrógeno y luz
ultravioleta; se variaron diversos parámetros como: cantidad de peróxido de hidrógeno
adicionado, tiempo de digestión y pH. De cada una de las soluciones de trabajo de selenito
de sodio y seleno–DL-metionina, se prepararon soluciones de trabajo de 5 mg L
–1
de las
cuales se tomaron 5 mL de cada solución para el estudio de las condiciones experimentales
del método propuesto. Se adicionaron diferentes cantidades de peróxido de hidrógeno para
llevar a cabo la oxidación completa de los compuestos puros de selenio a selenato. El
volumen se varió desde 100 μL hasta 3000 μL.
2.4. Aplicación del método
2.4.1. Validación del método para la determinación de selenio total en muestras
de cerveza
Tratamiento analítico de muestras de cerveza: Las muestras de cerveza fueron obtenidas
de una empresa cervecera de la localidad. Estas muestras se desgasificaron por un tiempo
de 2 horas eliminando de esta forma todo el dióxido de carbono y luego fueron filtradas,
para posteriormete guardarse en envases plásticos a una temperatura de 4°C para su
posterior análisis (Clesceri, Greenberg & Rhodes, 1989).
2.4.2. Optimización de las condiciones cromatográficas para el análisis de muestras
de cerveza
Se establecieron las condiciones cromatográficas óptimas del análisis de la muestra de
cerveza, variando las concentraciones de la fase móvil (Na
2
CO
3
/NaHCO
3
) para separar los
iones Se(IV) y Se(VI) en presencia de otros iones (NO
2
–
, NO
3
–
, PO
4
3–
y SO
4
2–
). Al emplear
el eluente 1,7/1,8 mM de NaHCO
3
/Na
2
CO
3
en muestras de cerveza, fueron encontrados
MSc. Jenifer Smith et al.
8
interferencias de nitrato, fosfato y sulfato. Para eliminar tales interferencias se varió la
concentración de la mezcla de carbonato de sodio/carbonato ácido de sodio en diversas
proporciones y se empleó hidróxido de sodio/carbonato de sodio. Las concentraciones de
las mezclas se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Variaciones de la fase móvil para la optimización la separación cromatográfica de Se(IV) y Se(VI)
Mezclas
Concentraciones
Na
2
CO
3
/NaHCO
3
1,3 mM/1,4mM
Na
2
CO
3
/NaHCO
3
2,0 mM/2,0 mM
Na
2
CO
3
/NaHCO
3
0,75 mM/1,8 mM
Na
2
CO
3
/NaHCO
3
0,75 mM/2,7 mM
NaOH/Na
2
CO
3
1,0 mM/2,0 mM
De igual forma se empleó un flujo de 1 mL min
–1
en todos los análisis cromatográficos y se
utilizó agua desionizada como solución regenerante de la columna supresora.
2.4.3. Procedimiento de digestión de muestras de cerveza para la validación del
método propuesto.
Las muestras de cerveza fueron digeridas de acuerdo a las condiciones de análisis
establecidas. Para ello, se tomó 0,5 mL de muestra donde se le adicionó 1 mL de H
2
O
2
al
30% v/v y colocadas en la luz UV durante 30 min. Pasado este tiempo, y esperado a que
las muestras estuvieran a temperatura ambiente, se llevaron a un volumen final de 5 mL
para luego ser cuantificadas en el cromatógrafo iónico. Cada muestra de cerveza fue
digerida por triplicado junto con un blanco y se leyeron por triplicado.
2.4.4. Determinación de selenito y selenato en muestras de cerveza sin la aplicación
del sistema oxidante (H
2
O
2
/UV)
Para la determinación de las concentraciones de los iones selenito y selenato en muestras
de cerveza, se tomaron 3 mL de muestra de cerveza y se llevó a un volumen fijo de 10 mL,
para luego ser cuantificadas por el cromatógrafo iónico, donde se leyeron por triplicado.
2.4.5. Determinación de selenio total en muestras de cerveza por medio de la técnica
ICP-AES
Para evaluar la eficiencia del método propuesto, se determinó el contenido de selenio total
presente en las muestras de cerveza mediante ICP-AES. Para ello, se tomaron 3 mL de
muestra y se le adicionó 1 mL de HNO
3
directamente dentro de los envases de PTFE de
las bombas de alta presión, cada una de las muestras fueron digeridas por un tiempo de 4
horas a una temperatura de 110°C. Cada muestra se analizó por triplicado junto con su
Desarrollo de un Método para la Especiación de Selenio en Muestras de Cerveza
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 9
blanco. Los resultados obtenidos fueron comparados mediante pruebas estadísticas de
significancia con los resultados en la determinación de selenio total empleando peróxido de
hidrógeno y luz ultravioleta.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Identificación y cuantificación
En las Figuras 1 y 2 se muestran los cromatogramas correspondientes a los iones Se(IV)
y Se(VI) a diferentes concentraciones, obtenidos a partir de soluciones de trabajo. Como
se puede observar tanto el ión Se(IV) como el ión Se(VI) presentan un rango de respuesta
lineal lo suficientemente amplio para una buena cuantificación, así como también una alta
simetría en las señales cromatográficas, lo que refleja una buena selectividad del sistema
cromatográfico (Miller & Miller, 2001).
Figura 1. Cromatograma CI de ión Se(IV) a
diferentes concentraciones (0.5; 1.0; 3.0 y 5.0 mg
L
–1
). Condiciones experimentales: columna de
aniones AS4A, precolumnaAG4A; Eluente1,8 mM
Na
2
CO
3
/1,7 mM NaHCO
3
; velocidad de flujo 1 mL
min
–1
, detector de conductividad con una
sensibilidad de 50 μS.
Figura 2. Cromatograma CI de ión Se(VI) a diferentes
concentraciones (0.5; 1.0; 3.0 y 5.0 mg L
–1
).
Condiciones experimentales: columna de aniones
AS4A, precolumna AG4A; Eluente1,8 mM Na
2
CO
3
/1,7
mM NaHCO
3
; velocidad de flujo 1 mL min
–1
, detector
de conductividad con una sensibilidad de 50 μS.
Como se puede apreciar en las figuras el ión Se(IV) presenta un menor tiempo de retención
con respecto al ión Se(VI). Esto es debido a la afinidad que presenta la fase estacionaria
con los distintos iones, ya que la fase estacionaria es capaz de aumentar la retención de
los iones a medida que se incrementa la relación carga/masa de éstos; por tanto, disminuye
el radio de hidratación y aumenta la polarizabilidad induciendo un dipolo y la atracción sobre
la resina.
Las curvas de calibración para Se (IV) fueron: y= 263,099x – 30,028, r
2
= 0,9993, LD= 0,15
mg L
–1
y y= 402,735x – 34,154 r
2
= 0,9998 LD= 0,28 mg L
–1
para Se (VI) respectivamente.
El análisis de estas figuras permite demostrar la proporcionalidad que existe entre las áreas
de picos con respecto a las concentraciones de cada uno de estos iones, reflejándose estas
MSc. Jenifer Smith et al.
10
proporcionalidades en los coeficientes de correlación (r). Los límites de detección obtenidos
fueron de 0,15 y 0,28 mgL
–1
para Se(IV) y Se(VI), respectivamente, se calcularon
empleando el método de regresión lineal, (y – y
B
= 2S
B
). En la Figura 3 se aprecia
claramente que no existe solapamiento cromatográfico de los iones Se(IV) y Se(VI).
Figura 3. Cromatograma IC de iones Se(IV) y Se(VI) con concentración 1 mg L
–1
. Condiciones
experimentales: columna de aniones AS4A, precolumna AG4A; Eluente1,8 mM Na
2
CO
3
/1,7 mM NaHCO
3
;
velocidad de flujo 1 mL min
–1
, detector de conductividad con una sensibilidad de 50 μS.
3.2. Desarrollo del método
3.2.1. Estudio de las condiciones experimentales para la digestión de compuestos
de selenio
En el proceso de digestión de compuestos de selenio empleando peróxido de hidrógeno y
luz ultravioleta como medio oxidante, se estudiaron diferentes mecanismos para llevar a
cabo la oxidación completa tanto del compuesto inorgánico (selenito de sodio) como del
compuesto orgánico (selenometionina), variando el volumen de peróxido de hidrógeno
adicionado, el tiempo de reacción y el pH.
3.2.1.1. Condiciones experimentales para la digestión del compuesto inorgánico
3.2.1.1.1. Variación de la cantidad de peróxido de hidrógeno (H
2
O
2
) adicionado
Como el selenito de sodio presenta una alta reactividad al oxidarse completamente a
Se(VI), aplicando como medio oxidante peróxido de hidrógeno y luz ultravioleta, fue el
primer compuesto de selenio estudiado. En la Figura 4 se puede observar que existe un
aumento continuo del porcentaje de recuperación de selenio (71,033,18 hasta 103 2,01),
cuya oxidación a iones Se(VI) se realizó en un tiempo de 30 minutos; esto se debe que a
medida que se aumenta la concentración de oxidante (H
2
O
2
), aumenta la formación del
radical hidroxilo (°OH) (Jackson & Hewitt, 1999). y por consiguiente aumenta el poder
Desarrollo de un Método para la Especiación de Selenio en Muestras de Cerveza
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 11
oxidativo. Sin embargo, cuando se adicionan volúmenes de 1000 a 3000 μL de oxidante,
no se observan diferencias significativas (103 2,01 a 103,51 4,87), ya que se alcanza el
equilibrio o límite máximo de oxidación de los iones Se(IV) a Se(VI).
Figura 4. Porcentaje de recuperación de selenio obtenido a partir de selenito de sodio, digerido con
diferentes volúmenes de H
2
O
2
al 30%
v
/
v
durante 30 min con luz UV.
También se puede apreciar en esta figura que cuando la solución de selenito de sodio se
expone a la luz UV por un tiempo de 30 min, sin agregar volumen de peróxido de hidrógeno,
no se produce oxidación, indicando que la irradiación con luz UV es insuficiente para
originar la oxidación de los iones Se(IV) a Se(VI). En la Figura 5, se muestra el
cromatograma correspondiente a estos análisis, donde los dos picos que aparecen a
tiempos de 2,0 y 2,9 min probablemente pertenezcan al radical hidróxilo formado por la
exposición del peróxido de hidrógeno a la radiación UV, los picos que aparecen a 6,3 y 12,5
min corresponde al ión nitrato y sulfato respectivamente; la presencia de estos dos últimos
iones en el cromatograma se debe a las impurezas que se encuentran presente en el
peróxido de hidrógeno, mientras que el pico asignado al ión Se(VI) aparece a un tiempo de
retención de 16,4 minutos.
Figura 5. Cromatograma CI de iones Se(VI)
obtenido a partir de selenito de sodio digerido con
diferentes volúmenes de H
2
O
2
al 30% v/v durante 30
min con luz UV. Condiciones experimentales:
columna de aniones AS4A, precolumna AG4A;
Eluente1,8 mM Na
2
CO
3
/1,7 mM NaHCO
3
; velocidad
de flujo 1 mL min
–1
, detector de conductividad con
una sensibilidad de 50 μS.
Figura 6. Cromatograma CI obtenido a partir de
agua desionizada digerido con 1000 µL de H
2
O
2
al
30% v/v durante 30 min con luz UV. Condiciones
experimentales: columna de aniones AS4A,
precolumna AG4A; Eluente1,8 mM Na
2
CO
3
/1,7 mM
NaHCO
3
; velocidad de flujo 1 mL min
–1
, detector de
conductividad con una sensibilidad de 50 μS.
MSc. Jenifer Smith et al.
12
En este cromatograma, se puede apreciar un incremento continuo del pico del ión Se(VI)
cuando se varía la concentración de (0,12%; 0,3%; 0,6%; 1,2%), es decir, al aumentar la
cantidad de peróxido de hidrógeno adicionado (100, 250, 500, 750 y 1000 μL). Sin embargo,
al agregar volúmenes mayores de 1000 μL la altura del pico se mantiene constante. Cabe
destacar en la Figura 5 que la presencia del ión Se(VI) en este cromatograma es
únicamente proveniente del selenito de sodio digerido con peróxido de hidrógeno, ya que
el peróxido de hidrógeno no genera señal cromatográfica en los tiempos de retención del
Se(IV) y Se(VI), es decir no causa interferencia, esto se puede observar en la Figura 6 que
muestra el cromatograma correspondiente al agua desionizada con 1000 L de peróxido
de hidrógeno (blanco), donde se observa la presencia de los iones nitrato y sulfato.
3.2.1.1.2. Variación del tiempo de exposición con UV
Cuando la solución de selenito de sodio se digiere empleando un volumen de 1000 μL de
peróxido de hidrógeno, se obtienen porcentajes de recuperación de 103,00 ± 2,01,
considerando que este volumen es el necesario para garantizar la oxidación completa de
los iones Se(IV) a Se(VI). No obstante, a pesar de los óptimos resultados obtenidos en un
tiempo de digestión de 30 minutos, se procedió a disminuir el tiempo de exposición con luz
UV, encontrándose resultados similares. En la Figura 7, se muestran los porcentajes de
recuperación obtenidos a partir de la digestión de la solución de selenito de sodio con 1000
μL de H
2
O
2
, a diferentes tiempos de exposición a luz UV.
Figura 7. Porcentaje de recuperación de
selenio obtenido a partir de selenito de sodio
digerido con 1000 L de H
2
O
2
al 30%
v
/
v
a
diferentes tiempos con luz UV.
Figura 8. Cromatograma CI de iones Se(VI) obtenido a
partir de selenito de sodio digerido con 1000 L de H
2
O
2
al 30%
v
/
v
durante 15 min con luz UV. Condiciones
experimentales: columna de aniones AS4A, precolumna
AG4A; Eluente 1,8 mM Na
2
CO
3
/1,7 mM NaHCO
3
;
velocidad de flujo 1 mL min
–1
, detector de conductividad
con una sensibilidad de 50 μS.
Como se puede apreciar en la Figura 7, a un tiempo de 15 min de exposición con radiación
UV empleando 1000 L de peróxido de hidrógeno se obtienen porcentajes de recuperación
de 99,03 1,35, representando este tiempo el óptimo para la oxidación de los iones Se(IV)
Desarrollo de un Método para la Especiación de Selenio en Muestras de Cerveza
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 13
a Se(VI). A tiempos mayores de 15 min de digestión se obtuvieron recuperaciones de
selenio mayores al 99%. Cabe destacar que la optimización de un método analítico consiste
en el empleo de la menor cantidad de reactivo en el menor tiempo posible. La Figura 8
muestra el cromatograma de la oxidación del selenito de sodio a iones Se(VI) empleando
estos parámetros.
El ión Se(VI) aparece a un tiempo de retención de 15,9 min. Este cambio del tiempo de
elución del ión Se(VI) se debe a cambios en la columna, debido a la limpieza de la misma
o la elución de otro tipo de solvente. Por esta razón diariamente fue evaluado el sistema de
calibración para los iones en estudio, asegurando de esta forma que los resultados
obtenidos sean los más reproducibles.
Establecidas las condiciones experimentales para la digestión del selenito de sodio, el
proceso químico que ocurre en dicha oxidación empleando peróxido de hidrógeno y luz
ultravioleta puede describirse mediante la siguiente ecuación (Liao, C. & Gurol, M., 1995):
SeO
3
2–
+ H
2
O
2
+ h SeO
4
2–
+ H
2
O [8]
En la Tabla 4 se resumen las condiciones experimentales obtenidas en el estudio de
optimización de la digestión de la solución de iones Se(IV).
Tabla 4. Condiciones experimentales obtenidas en el proceso de digestión de iones Se(IV) a Se(VI)
Cantidad de H
2
O
2
al 30% (L)
Tiempo de exposición UV (min)
pH del medio
1000
15
ácido
3.2.1.2. Condiciones experimentales para la digestión del compuesto orgánico
El estudio del compuesto orgánico (seleno-DL-metionina) se analizó empleando las mismas
condiciones experimentales obtenidas en el proceso de digestión del selenito de sodio
(Figura 9).
OH
O
NH
2
Se
Figura 9. Estructura química del compuesto orgánico seleno-DL-metionina.
Como prueba preliminar, la solución de seleno-DL-metionina fue digerida con 1000 L de
H
2
O
2
al 30% v/v y expuesta a la luz ultravioleta durante 15 min, en la cual no se obtuvo un
óptimo porcentaje de recuperación, ya que sólo el 37,51 2,79 es recuperado. La Figura
10 muestra el cromatograma correspondiente a este análisis.
Tomando en cuenta la poca recuperación de selenio como Se(VI), a partir de seleno-DL-
metionina, se realizaron variaciones en el volumen de peróxido de hidrógeno adicionado y
el tiempo de exposición a la luz UV, como se muestra en la Figura 11. Como se puede
MSc. Jenifer Smith et al.
14
observar en esta figura, no se obtuvieron buenos porcentajes de recuperación con la
variación del tiempo de exposición a la luz UV ni con el aumento de peróxido de hidrógeno
adicionado, ya que la máxima recuperación obtenida fue de 77,02 2,28. Una de las
posibles causas de que no ocurra una completa oxidación es la compleja estructura del
seleno-DL-metionina, pues el selenio se encuentra muy impedido para un ataque directo
del radical hidroxilo.
Con la finalidad de mejorar el proceso de digestión para éste compuesto orgánico, se realizó
un cambio de pH en el medio de reacción. Para ello, se estudió el comportamiento de la
seleno-DL-metionina en medio ácido y básico, empleando ácido clorhídrico e hidróxido de
sodio, respectivamente. La Figura 12, muestra los resultados obtenidos.
Figura 10. Cromatograma CI de iones Se(VI) obtenido a partir de seleno-DL-metionina digerido con 1000 L
de H
2
O
2
al 30%
v
/
v
durante 15 min con luz UV. Condiciones experimentales: columna de aniones AS4A,
precolumna AG4A; Eluente1,8 mM Na
2
CO
3
/1,7 mM NaHCO
3
; velocidad de flujo 1 mL min
–1
, detector de
conductividad con una sensibilidad de 50 μS.
Figura 11. Porcentaje de recuperación de selenio
obtenido a partir de seleno-DL-metionina digerida
con diferentes volúmenes de H
2
O
2
al 30%
v
/
v
a
diferentes tiempos con luz UV.
Figura 12. Porcentaje de recuperación de selenio
obtenido a partir de seleno-DL-metionina digerida
con 3000 L de H
2
O
2
al 30%
v
/
v
a 45 min con luz UV
y a diferentes valores de pH.
Tiempo de retención (min)
Conductividad (
S)
NO
3
–
SO
4
2–
Se(VI)
5,03
Desarrollo de un Método para la Especiación de Selenio en Muestras de Cerveza
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 15
La seleno-DL-metionina presenta un pH de 5,3, por lo tanto, al agregar 3000 L de peróxido
de hidrógeno, el pH del medio disminuye a 3,4 y con la adición de 50 L de HCl 0,1 M, el
pH varía a 2,7. Al agregar 100; 500 y 3500 L de hidróxido de sodio 0,1 M a la solución de
seleno-DL-metionina, el pH aumenta a 8; 9 y 10, respectivamente.
En la Figura 12 se puede observar que a pH ácidos existen mayores porcentajes de
recuperación que a pH básico, aunque los resultados obtenidos en el proceso de digestión
del seleno-DL-metionina no son óptimos debido a que la máxima recuperación de selenio
fue de 77,02% 2,28. Por otra parte, se puede apreciar que a medida que aumenta el pH
existe una disminución continua del porcentaje de recuperación.
Las Figuras 13 y 14 muestran los cromatogramas correspondientes a la oxidación de
seleno-DL-metionina a Se(VI) bajo condiciones ácidas y básicas. El pico que aparece a
2,703 min corresponde al ión Cl
–
mientras que el ión Se(VI) aparece a un tiempo de
retención de 11,207 min (Figura 13).
Figura 13. Cromatograma CI de iones Se(VI)
obtenido a partir de seleno-DL-metionina digerida
con 3000 L de H
2
O
2
al 30%
v
/
v
y 100 μLde ácido
clorhídrico 0,1M (pH=2,7) durante 45 min con luz
UV. Condiciones experimentales: columna de
aniones AS4A, precolumna AG4A; Eluente1,8 mM
Na
2
CO
3
/1,7mM NaHCO
3
; velocidad de flujo 1 mL
min
–1
, detector de conductividad con una
sensibilidad de 50 μS.
Figura 14. Cromatograma CI de iones Se (VI)
obtenido a partir de seleno-DL-metionina digerido
con 3000 L de H
2
O
2
al 30%
v
/
v
y 3,5 mLde hidróxido
de sodio 0,1M (pH=10) durante 45 min con luz UV.
Condiciones experimentales: columna de aniones
AS4A, precolumna AG4A; Eluente1,8 mM
Na
2
CO
3
/1,7 mM NaHCO
3
; velocidad de flujo 1 mL
min
–1
, detector de conductividad con una
sensibilidad de 50 μS.
En el cromatograma de la Figura 14, el pico que aparece a un tiempo de retención de
11,070 min se le asigna al ión Se(VI). En la Figura 14 se puede apreciar una pequeña área
del pico para el Se(VI) cuando el medio de reacción es llevado a un pH básico.
Después de realizar pruebas preliminares a la seleno-DL-metionina variando los
parámetros obtenidos en la oxidación del selenio inorgánico, no se encontró un medio de
reacción con resultados lo suficientemente buenos para comenzar una optimización de las
condiciones, por lo que se tuvo que realizar la variación de un cuarto parámetro, como lo
era la cantidad de analito presente en la solución de trabajo. A partir de los resultados
mostrados en la Figura 15, se encontró un buen porcentaje de recuperación del contenido
MSc. Jenifer Smith et al.
16
de selenio como Se(VI) a partir del seleno-DL-metionina (98,61% 1,13) al utilizarse una
cantidad de muestra de 0,5 mL.
Figura 15. Porcentaje de recuperación de selenio
obtenido a partir de diferentes cantidades de seleno-
DL-metionina digerida con 1000 L de H
2
O
2
al 30%
v
/
v
a 45min con luz UV.
Figura 16. Porcentaje de recuperación de selenio
obtenido a partir de seleno-DL-metionina digerida
con 1000 L de H
2
O
2
al 30%
v
/
v
a diferentes tiempos
con luz UV.
Luego de haber encontrado un medio de reacción donde la oxidación es completa, se
procedió a optimizar las condiciones experimentales de oxidación del selenio orgánico a
iones Se(VI).
3.2.1.2.1. Variación del tiempo de exposición con UV
Cuando la solución de seleno-DL-metioninase digiere empleando un volumen de 1000 μL
de peróxido de hidrógeno a un tiempo de exposición con luz UV de 45 min, se obtienen
porcentajes de recuperación de 98,61 1,13. No obstante, debido al largo tiempo de
análisis se procedió a disminuir el tiempo de exposición con luz UV, encontrándose
resultados similares a un tiempo de 30 min. En la Figura 16, se muestran los porcentajes
de recuperación obtenidos a partir de la digestión de la solución de seleno-DL-metioninacon
1000 μLde peróxido de hidrógeno, a diferentes tiempos de exposición a la luz UV. Como se
puede apreciar en esta figura, a un tiempo de 30 min de exposición con radiación UV se
obtienen buenos porcentajes de recuperación (101,17 1,94), representando este tiempo
el óptimo para la oxidación de seleno-DLmetioninaa iones Se(VI). La Figura 17 muestra el
cromatograma correspondiente a este estudio.
3.2.1.2.2. Variación de la cantidad de peróxido de hidrógeno (H
2
O
2
) adicionado
En la Figura 18 se puede observar que, al emplear volúmenes de 500 a 1000 μL de
peróxido de hidrógeno, existe un aumento del porcentaje de recuperación de selenio
(56,16% 3,64 a 101,17% 1,94), cuya oxidación a iones Se(VI) se realizó en un tiempo
de 30 minutos. Sin embargo, al incrementar el volumen de peróxido de hidrógeno
adicionado (1000 a 3000 μL), es decir, al aumentar la concentración de 3% a 9%, se
observa que el porcentaje de recuperación se mantiene constante.
Desarrollo de un Método para la Especiación de Selenio en Muestras de Cerveza
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 17
En esta Figura 18 se puede apreciar también que cuando la solución de seleno-DL-
metionina se expone a la luz UV por un tiempo 30 min, sin agregar volumen de peróxido de
hidrógeno, no se observa oxidación alguna a iones Se(VI).
Figura 17. Cromatograma CI de iones Se (VI)
obtenido a partir de 0,5 mL de seleno-DL-metionina
digerida con 1000 L de H
2
O
2
al 30%
v
/
v
durante 30
min con luz UV. Condiciones experimentales:
columna de aniones AS4A, precolumna AG4A;
Eluente1,8 mM Na
2
CO
3
/ 1,7 mM NaHCO
3
; velocidad
de flujo 1 mL min
–1
, detector de conductividad con una
sensibilidad de 50 μS.
Figura 18. Porcentaje de recuperación de selenio
obtenido a partir de 0,5 mL de seleno-DL-
metionina digerido con diferentes volúmenes de
H
2
O
2
al 30%
v
/
v
durante 30 min con luz UV.
La Figura 19 muestra el cromatograma obtenido a partir de la digestión del selenio
orgánico, empleando 0,5 mL de muestra con 3000 L de peróxido de hidrógeno durante 30
min de exposición a la luz UV, este cromatograma muestra que el pico que aparece a un
tiempo de retención de 11,071 min es el ión selenato.
Figura 19. Cromatograma CI de iones Se(VI) obtenido a partir de 0,5 mL de seleno-DL-metionina digerida
con 3000 L de H
2
O
2
al 30%
v
/
v
durante 30 min con luz UV. Condiciones experimentales: columna de aniones
AS4A, precolumna AG4A; Eluente1,8 mM Na
2
CO
3
/1,7 mM NaHCO
3
; velocidad de flujo 1 mL min
–1
, detector
de conductividad con una sensibilidad de 50 μS.
Las condiciones experimentales obtenidas en el proceso de digestión del seleno-DL-
metionina a iones Se(VI) fueron las siguientes:
MSc. Jenifer Smith et al.
18
Cantidad de
muestra (L)
Cantidad de H
2
O
2
al 30%
(L)
Tiempo de exposición UV
(min)
pH del
medio
500
1000
30
ácido
De esta manera, el método desarrollado para la determinación de selenio total en muestras
de selenio orgánico por cromatografía iónica mediante el empleo de peróxido de hidrógeno
y luz ultravioleta consiste en la digestión de 0,5 mL de muestra, en el cual se adicionó 1000
L de H
2
O
2
al 30% v/v en un tiempo de exposición a la luz ultravioleta de 30 min
3.3. Estudio de interferencia
Dado que el Se(IV) y el Se(VI) no presentan problemas de interferencias entre sí en la
separación cromatográfica por CI empleando como fase móvil 1,8 mM Na
2
CO
3
/1,7 mM
NaHCO
3
, se garantizan los satisfactorios resultados obtenidos en la optimización del
método. Sin embargo, para la aplicación del método a una muestra tan compleja como es
la cerveza, se estudió la separación de los iones Se(IV) y el Se(VI) en presencia de otros
iones (NO
2
–
, NO
3
–
, HPO
4
2–
y SO
4
2–
).
En la Figura 20 se muestra el cromatograma obtenido a partir de una solución de Se(IV) y
Se(VI) contaminada con diversos iones (NO
2
–
, NO
3
–
, HPO
4
2–
y SO
4
2–
) a concentraciones de
1,5 mg L
-1
, empleando las condiciones cromatográficas establecidas. Estos iones tienen
tiempo de retención cercanos a los iones de selenio investigados.
Figura 20. Cromatograma CI de mezcla de iones
a concentraciones de 1,5 mg L
-1
. Condiciones
experimentales: columna de aniones AS4A,
precolumna AG4A; Eluente1,8 mM Na
2
CO
3
/1,7
mM NaHCO
3
; velocidad de flujo 1 mL min
–1
,
detector de conductividad con una sensibilidad de
50 μS.
Figura 21. Cromatogramas CI obtenido a partir de
soluciones de selenito de sodio (línea continua) y
ácido fosfórico (línea discontinua) 1 mgL
–1
.
Condiciones experimentales: columna de aniones
AS4A, precolumna AG4A; Eluente1,8 mM Na
2
CO
3
/1,7
mM NaHCO
3
; velocidad de flujo 1 mL min
–
, detector
de conductividad con una sensibilidad de 50 μS.
Al analizar esta figura se puede observar que el pico que aparece a un tiempo de retención
de 7,49 min es asignado al ión Se(IV). No obstante, este pico aparece solapado con el ión
HPO
4
2–
(previamente estandarizado), causando de esta forma interferencia en la
separación y cuantificación del ión Se(IV). Debido a este inconveniente se realizó el estudio
de la mínima concentración de HPO
4
2–
capaz de interferir en la resolución y cuantificación
del iónSe(IV). En la Figura 21 se aprecia tal análisis.
Desarrollo de un Método para la Especiación de Selenio en Muestras de Cerveza
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 19
El pico que aparece a un tiempo de retención de 7,776 min se le asigna al ión Se(IV),
mientras que el pico asignado al ión HPO
4
2–
aparece a un tiempo de retención de 7,531
min. Por medio de este análisis se obtuvo que a partir de concentraciones mayores de 0,05
mg L
–1
la señal cromatográfica del ión Se(IV) es afectada por el ión HPO
4
2–
. Para garantizar
la separación cromatográfica de los iones Se(IV) y Se(VI) en presencia de otros iones, se
varió la concentración de la mezcla del eluente carbonato de sodio y bicarbonato de sodio
(Na
2
CO
3
/NaHCO
3
) en diversas proporciones.
La mejor separación cromatográfica encontrada de los iones Se(IV) y Se(VI) en presencia
de otros iones, se logró empleando la mezcla de 1,0 mM NaOH/2,0 mM Na
2
CO
3
(Niss et al.
1993). En la Figura 22 se puede observar el cromatograma correspondiente a este estudio.
La separación cromatográfica dada en este cromatograma proporciona una buena
separación de los iones en estudio, debido a que se obtiene una buena resolución en los
picos cromatográficos. El empleo del eluente de carbonato de sodio/hidróxido de sodio
elimina la interferencia del ión Se(IV) con el PO
4
3–
, debido a que el pH del eluente es mayor
(pH=10) al formado por la mezcla de carbonato de sodio/carbonato ácido de sodio (pH=9),
originando que el fosfato presente en la mezcla se encuentra en la forma PO
4
3–
,
aumentando de esta manera el tiempo de retención y efectivamente la separación con el
ión Se(IV) (Niss et al. 1993). En la Figura 23 se muestran los sistemas de calibración de
los iones Se(IV) y Se(VI), donde a partir de éstas se pudo cuantificar la concentración de
estos iones en la muestra de cerveza.
Figura 22. Cromatograma CI de mezcla de iones a
concentraciones de 1,5 mg L
-1
. Condiciones
experimentales: columna de aniones AS4A,
precolumna AG4A; Eluente: 1,0 mM NaOH/2,0 mM
Na
2
CO
3
; velocidad de flujo 1 mL min
–1
, detector de
conductividad con una sensibilidad de 50 μS.
Figura 23. Curva de calibración para determinar
niveles de concentración de iones Se(IV) y Se(VI).
Condiciones experimentales: columna de aniones
AS4A, precolumna AG4A; Eluente1,0 mM
NaOH/2,0 mM Na
2
CO
3
; velocidad de flujo 1 mL
min
–1
, detector de conductividad con una
sensibilidad de 50 μS.
Los límites de detección obtenidos empleando esta nueva condición cromatográfica fue de
0,08 mg L
–1
para Se(IV) y 0,07 mg L
–1
para Se(VI). Al comparar estos límites de detección
con los obtenidos en la literatura (Niss et al. 1993) que fueron de 0,05 mg L
–1
para los dos
MSc. Jenifer Smith et al.
20
iones, respectivamente; se puede apreciar que existen pequeñas diferencias entre los
valores obtenidos y los citados en la literatura, indicando que esta nueva fase móvil permite
una mejor cuantificación, además de una buena separación de los iones en estudio
3.4. Aplicación del método
3.4.1. Validación del método para la determinación de selenio total en muestras de
cerveza
La metodología establecida se aplicó a tres muestras de cerveza para determinar el
contenido de selenio total. Previo a éste análisis, las muestras se analizaron en el CI para
cuantificar la cantidad de Se(IV) y Se(VI) presente, y de ésta manera determinar la cantidad
de selenio oxidado cuando se aplica el sistema H
2
O
2
/UV. Cabe destacar que la muestra de
cerveza presenta un pH 4,3, lo cual puede considerarse como medianamente ácido. Por lo
tanto, el pH del medio de reacción varió a 3,4 al agregar 1000 µL de peróxido de hidrógeno.
La Figura 24 muestra el cromatograma de la muestra de cerveza sin aplicar el sistema
H
2
O
2
/UV, empleando las condiciones cromatográficas establecidas para la separación de
los iones en estudio de los problemas de interferencias de nitrato, fosfato y sulfato.
Como se puede observar en esta figura que el ión Se(IV) se encuentra separado de los
iones nitrato, fosfato y sulfato. En este cromatograma no se aprecia la elución del ión Se(VI)
que aparece a un tiempo de retención aproximadamente de 9 min, pudiéndose explicar
debido a que la concentración de este ión se encuentre por debajo de los límites de
detección del CI.
Figura 24. Cromatograma CI obtenido a partir de 3
mL de muestra de cerveza sin digestión. Condiciones
experimentales: columna de aniones AS4A,
precolumna AG4A; Eluente 1,0 mM NaOH/2,0 mM
Na
2
CO
3
; velocidad de flujo 1 mL min
–1
, detector de
conductividad con una sensibilidad de 50 μS.
Figura 25. Cromatograma CI obtenido a partir de
0,5 mL de muestra de cerveza digerida con 1000
L de H
2
O
2
al 30%
v
/
v
durante 30 min con luz UV.
Condiciones experimentales: columna de aniones
AS4A, precolumna AG4A; Eluente 1,0 mM
NaOH/2,0 mM Na
2
CO
3
; velocidad de flujo 1 mL
min
–1
, detector de conductividad con una
sensibilidad de 50 μS.
En la Figura 25 se aprecia el cromatograma correspondiente al emplear el sistema oxidante
a la muestra de cerveza, para evaluar de esta forma la eficiencia del método propuesto. Al
Desarrollo de un Método para la Especiación de Selenio en Muestras de Cerveza
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 21
estudiar esta figura se puede apreciar que el empleo del sistema oxidante H
2
O
2
/UV
proporciona buenos resultados para la determinación de selenio, ya que las diferentes
especies de selenio fueron oxidadas a iones Se(VI) como producto final; esto se puede
confirmar en el cromatograma que aparece la elución del ión Se(VI) a un tiempo de
retención de 9,542 min. Para evaluar la eficiencia del método propuesto, se determinó en
estas mismas muestras la cantidad de selenio total mediante la técnica ICP-AES. Los
resultados obtenidos por las dos metodologías fueron comparados mediante un tratamiento
estadístico de pruebas de significancia, en el cual se aplicó la prueba t de comparación de
las medias de dos muestras y la prueba F para la comparación de las desviaciones estándar
(Miller & Miller, 2001).
En la Tabla 5 se muestran las concentraciones obtenidas de las diferentes formas del
selenio encontradas en la muestra de cerveza y las concentraciones de selenio total
obtenidos por las dos técnicas (CI y ICP-AES).
Tabla 5. Resultados de la especiación de selenio en muestras de cerveza (mg L
-1
)
H
2
O
2
/UV
(a)
Se total
ICP-AES
(b)
Se total
Se(-II)
(a)
Selenio orgánico
Se(IV)
(a)
selenito
Se(VI)
(a)
selenato
0,78380,04
0,78010,03
0,57950,02
0,19770,03
<LD
LD=0,07
(a) La cantidad de selenio total reportada está contenida en 0,005 L de solución (n=3).
(b) La cantidad de selenio total reportada está contenida en 0,01 L de solución (n=3).
Los resultados obtenidos en el estudio estadístico, tanto para la prueba t de comparación
de las medias de dos muestras como para la prueba F son menores que el valor crítico
establecido para dos grados de libertad y un nivel de confianza de 90% (0,10). Esto significa
que la metodología desarrollada para la determinación de selenio total mediante el empleo
de peróxido de hidrógeno y luz ultravioleta proporciona resultados tan precisos y exactos
como los obtenidos mediante la técnica ICP-AES. Las especies encontradas en las
muestras de cerveza son las esperadas, debido a que la levadura es unos de los
componentes de la cerveza, la cual contiene selenio orgánico y que al oxidarse predominará
el Se(VI). El selenio presente en las muestras de cerveza se encuentra en un nivel promedio
de 0,7819 mg L
–1
, lo cual excede el límite de concentración permisible establecido en la
Norma Venezolana COVENIN sobre la Clasificación de las aguas envasadas, siendo el
nivel de concentración referencial de 0,01 mg L
–1
de selenio (Norma Venezolana,
COVENIN. No. 1431, 1982). En este sentido, el selenio presente en la cerveza puede
causar daños para la salud, por lo tanto, se deben tomar medidas preventivas para mejorar
el control de calidad.
MSc. Jenifer Smith et al.
22
4. CONCLUSIONES
La oxidación completa de los iones Se(IV) a Se(VI) se llevó a cabo satisfactoriamente con
5 mL de la solución de trabajo, empleando 1000 L de peróxido de hidrógeno al 30%
v
/
v
en
un tiempo de exposición a la luz ultravioleta de 15 min. Bajo éstas condiciones
experimentales se obtuvo un porcentaje de recuperación de 99,03%1,35.
El medio óptimo de reacción para la oxidación de los iones Se(IV) a Se(VI) fue a pH ácido.
La oxidación completa del contenido de selenio presente en el compuesto orgánico seleno-
DL-metionina a iones Se(VI) se llevó a cabo tomando 0,5 mL de muestra, empleando 1000
L de peróxido de hidrógeno al 30%
v
/
v
en un tiempo de exposición a la luz ultravioleta de
30 min.
El medio de reacción óptimo para la oxidación de la seleno-DL-metionina a Se(VI) se llevó
a cabo en medio ácido.
El método propuesto se aplicó a muestras de cerveza con el resultado de selenio total de
0,7838 mg L
–1
. El método propuesto se validó mediante la determinación de selenio total a
muestras de cervezas por ICP-AES.
5. REFERENCIAS
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