Publicación Cuatrimestral. Vol. 3, Año 2018, N
o
1 (45-56).
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE
LEVADURAS AUTÓCTONAS EN VIÑEDO DE LA VARIEDAD
MALVASÍA BLANCA
Dra. María Berradre
a*
, Lcda. Luzmila Meza
b
, Dr. Braulio Esteve-Zarzoso
c
, MSc. Jorge
Ortega
d
, MSc. Betzabé Sulbarán
a
, MSc. Graciela Ojeda
a
, MSc. Laura Soto
a
, MSc.
Mairy Fuenmayor
a
a
Laboratorio de Alimentos. Facultad Experimental de Ciencias. Universidad del Zulia (LUZ), Venezuela.
b
Laboratorio de Micología. Facultad de Medicina. Universidad del Zulia (LUZ), Venezuela.
c
Deparment de Bioquímica y Biotecnología. Facultat d´Enología. Universitat Rovira i Virgili. Marcel.lí
Domingo s/n, 43007. Tarragona, España.
d
Departamento de Estadística. Facultad de Agronomía. Universidad del Zulia (LUZ), Venezuela.
*Autor para la correspondencia. Email: marinaty@gmail.com
Recibido: 8-2-2018 / Aceptado: 30-4-2018
RESUMEN
Se realizó el aislamiento e identificación de levaduras nativas de un viñedo de la especie Vitis vinifera variedad
Malvasía blanca, en la Región Zuliana. Se muestrearon aséptica y aleatoriamente bayas y partes de la planta
(hojas, raquis, corteza y suelo), de un total de 123 plantas, correspondientes a un viñedo de la variedad de
uva Malvasía. A aproximadamente a 500m del viñedo, se encuentra la bodega. La identificación de las
levaduras aisladas en el viñedo se realizó por técnicas moleculares mediante PCR-RFLP, sometiendo los
productos amplificados a un análisis de restricción con las enzimas Hinf I, Hae III, CfoI y DdeI. La distribución
de las levaduras en los diversos sustratos fue en el suelo 60% Hanseniaspora guillermondii y 40%
Hanseniaspora uvarum, en la corteza 90% Candida sake y 10% Hanseniaspora uvarum, en hojas 100% por
Rhodotorula mucilagenosa, en raquis 100% por Aureobasidium pullulans y en las bayas 96% Rhodotorula
mucilagenosa y 4% Aureobasidium pullulans. En el viñedo están ampliamente difundidos los géneros
Ascomycetos Hanseniaspora, Candida y Aureobasidium y el género Basdiomycetos Rhodotorula, siendo las
levaduras oxidativas Aureobasidium y Rhodotorula las de mayor difusión en el mismo, sin embargo, cabe
destacar la presencia de levaduras fermentativas como los géneros Hanseniaspora y Candida, importantes
levaduras con reconocido potencial enológico, que podrán ser utilizadas en futuras fermentaciones
alcohólicas para obtener vinos con calidad única por ser fermentados con levaduras autóctonas adaptadas a
clima tropical.
Palabras clave: levaduras autóctonas, variedad Malvasía, PCR-RFLP 5,8S.
ISOLATION AND MOLECULAR IDENTIFICATION OF
AUTOCHTHONOUS YEASTS IN THE VINEYARD OF THE
MALVASÍA WHITE
ABSTRACT
Ciencias
Químicas
Artículo de Investigación
Dra. María Berradre
et al.
46
The isolation and identification of native yeasts from a vineyard of the Vitis vinifera white variety Malvasia was
carried out in Zulia, Venezuela. Aseptically and randomly, berries and parts of the plant (leaves, rachis, bark
and soil) were sampled from a total of 123 plants, corresponding to a vineyard of the Malvasia grape variety.
A winery is located at approximately 500 m from the vineyard. The identification of the yeasts isolated in the
vineyard was carried out by molecular techniques by PCR-RFLP, subjecting the amplified products to a
restriction analysis with the enzymes Hinf I, Hae III, CfoI and DdeI. The distribution of the yeasts in the different
substrates was in the soil 60% Hanseniaspora guillermondii and 40% Hanseniaspora uvarum, in the bark 90%
Candida sake and 10% Hanseniaspora uvarum, in leaves 100% by Rhodotorula mucilagenosa, in rachis 100%
by Aureobasidium pullulans and in berries 96% Rhodotorula mucilagenosa and 4% Aureobasidium pullulans.
In the vineyard, the Ascomycetos type Hanseniaspora, Candida and Aureobasidium and the genus
Basdiomycetos Rhodotorula are widely spread, with the oxidative yeasts Aureobasidium and Rhodotorula
being the most widespread, however, the presence of fermentative yeasts such as the Hanseniaspora and
Candida genera, important yeasts with recognized oenological potential, which can be used in future alcoholic
fermentations to obtain wines with unique quality by being fermented with native yeasts adapted to tropical
climate.
Key words: native yeasts, Malvasía variety, PCR-RFLP 5.8S.
ISOLAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE LEVEDURAS
NATIVAS EM VINHEDOS DE VARIEDADE DE UVAS MALVASÍA
BLANCA
RESUMO
O isolamento e identificação de leveduras nativas de uma vinha da espécie Vitis vinifera variedade Malvasia
branco foi realizada na região dO Zulia. A amostragem foi realizada de forma asséptica e aleatoriamente entre
bayas e partes dase plantas (folhas, ráquis, casca, solo), um total de 123 plantas, correspondentes a uma
vinha Malvasía variedade de uva. Aproximadamente 500 m da vinha, encontra-se armazenadas. A
identificação dase leveduras isoladas na vinha forami realizadas por meio de técnicas moleculares como PCR-
RFLP, submetendo produtos amplificados para análise de restrição com Hinf I, Hae III, Cfol e enzima Ddel. A
distribuição de leveduras em vários substratos no solo foram de 60% Hanseniaspora guillermondii e 40%
Hanseniaspora uvarum, nao crosta 90% Cândida sake e 10% Hanseniaspora uvarum, folhas de 100% por
Rhodotorula mucilagenosa, em raque 100% por Aureobasidium pullulans, bayas 96% Rhodotorula
mucilagenosa e 4% Aureobasidium pullulans. Nos géneros vinhedo Ascomycetes Hanseniaspora, Candida e
Aureobasidium pullulans e do género Basdiomycetos Rhodotorula são generalizadas, assim, a levedura
Aureobasidium Rhodotorula oxidativo foram as de maior difussão, no entanto, incluem a presença de
productos de fermentação de levedura como aquelas dos gêneros Hanseniaspora e Candida, importantes
leveduras enológicas com reconhecido potencial, que podem ser utilizados em fermentações alcoólicas
futuras para obter vinhos de qualidade únicas que possam ser fermentados com leveduras indígenas
adaptadas ao clima tropical.
Palavras-chave: leveduras autóctones, variedade Malvasia, PCR-RFLP 5,8S.
1. INTRODUCCIÓN
La fermentación del jugo de uva en vino consiste en un complejo proceso bioquímico y
ecológico que envuelve el desarrollo secuencial de diferentes especies de levaduras
(Beltrán et al., 2002). El origen de la flora natural de levaduras que están involucradas en
la elaboración de vino se ha estudiado extensamente, existiendo dos posibles fuentes de
Aislamiento e Identificación Molecular de Levaduras Autóctonas en Viñedo de la Variedad Malvasía Blanca
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 47
levaduras responsables de la fermentación alcohólica: las provenientes del viñedo y las
provenientes de la bodega (Sábate, Cano, Esteve-Zarzoso & Guillamón, 2002; Li et al.,
2010). La primera incluye las levaduras provenientes, especialmente de la piel de las uvas
y otros órganos de la planta y la segunda incluye los equipos de la bodega (Francesca et
al., 2016; Boynton & Greig, 2016).
Estudios recientes indican que se han aislado levaduras del ecosistema del viñedo tales
como suelo, aire, hojas, uvas y diversos animales vectores (Portillo & Mas, 2016), así como
también del ecosistema de la bodega como en equipos, suelo, utensilios, paredes y cubas
de fermentación (Raspor et al., 2006). La composición de la población de levaduras sobre
las bayas juega un rol importante en las fermentaciones de vinos (Tristezza et al., 2013).
La actividad metabólica de los diferentes géneros y especies influencian la calidad sensorial
y las características organolépticas del vino (Raspor et al., 2006). Los más recientes
estudios están en común acuerdo en que las levaduras apiculadas han sido las especies
predominantes sobre las superficies de las baya, Hanseniaspora uvarum (y su forma
anamorfa Kloeckera apiculata) en 50-75% de la población total de levaduras (Grangeteau
et al., 2015) y en menor población Candida, Pichia, Cryptococcus, Rhodotorula,
Metschnikowia, Kluyveromyces y Hansenula (Moreira et al., 2011), la presencia de estas
levaduras no- Saccharomyces durante las fermentaciones se limita a los primeros días de
la fermentación por la elevada producción de etanol generada por las levaduras
Saccharomyces, sin embargo, su presencia aporta beneficios como la mejora desde el
punto de vista sensorial al vino en cuanto aromas y tipicidad, siendo esto debido a que las
levaduras no- Saccharomyces poseen unas enzimas diferentes a las levaduras
Saccharomyces, que interactúan con los metabolitos de la fermentación, generando
compuestos aromáticos de calidad óptima desde el punto de vista sensorial, por eso lo
importante de su participación en las fermentaciones (Tristezza et al., 2013; Portillo & Mas,
2016). Contrario a lo que lógicamente se pensaba, las especies fermentativas de
Saccharomyces (e.j. Saccharomyces cerevisiae) se han aislado en muy baja población
sobre bayas sanas y han sido extrañamente aisladas de granos de uva intactos y de suelos
de viñedos (Raspor et al., 2006; Barrajon et al., 2009). Se ha comprobado que estas
especies fermentativas están asociadas con el área de la bodega (Beltrán et al., 2002;
Sábate et al., 2002) y que son incorporadas dentro del mosto durante el tratamiento
mecánico de la uva y el proceso de fermentación (Li et al., 2010; Sun et al., 2009).
El cultivo de la uva en el Municipio Mara del Estado Zulia, Venezuela, es uno de los rubros
que ha tenido mayor desarrollo, debido a que la zona presenta las condiciones climáticas
Dra. María Berradre
et al.
48
requeridas por el cultivo de la vid, que han permitido la adaptación de las diferentes
variedades de uva de vino que se siembran en la región. Para el año 2.000 la producción
de uva de vino en el estado Zulia alcanzó una producción de 1.600.000 Kg con un
rendimiento de 20 toneladas.ha.año
-1
en una superficie sembrada de 80 hectáreas, de la
cual el 50% es procesado en el Centro de Desarrollo Vitícola Tropical del estado Zulia y el
otro 50% fue llevado a Industrias IPECA. Las únicas variedades de uva de vino que se
cultivan en la región zuliana están la Variedad Malvasía (uva blanca) y la variedad
Tempranillo (uva tinta) (Molero, Guerrero & Martínez, 2007). En la actualidad, en el estado
Zulia las fermentaciones alcohólicas se llevan a cabo mediante inoculación de levaduras
importadas, provenientes de ceparios de reconocida calidad, seleccionadas para fermentar
mostos en países de climas templados con alta capacidad para la producción de vino, pero
no con levaduras adaptadas a las condiciones climáticas de la región, que generen vinos
con características sensoriales propias. Aunado a ello está el alto costo de las levaduras
secas activas importadas, que encarecen el negocio de la producción de vinos en la región,
mientras que al aislar e identificar las levaduras de la región se estarían disminuyendo esos
costos. Ciertamente, se pueden aislar levaduras tanto del área del viñedo como del área de
la bodega, como arriba se mencionó, sin embargo, es preciso conocer las levaduras del
viñedo, para así seleccionar que género de levaduras no-Saccharomyces presentes en el
viñedo con potencial enológico importante se puedan utilizar para futuras fermentaciones
alcohólicas.
El objetivo de la investigación fue aislar e identificar las levaduras nativas de un viñedo de
la especie Vitis vinifera variedad Malvasía blanca en la Región Zuliana que posteriormente
serán empleadas para la elaboración de vinos tropicales en la región zuliana.
2. PARTE EXPERIMENTAL
2.1. Muestreo
Se recolectaron tres bolsas plásticas ziplot de muestras para cada uno de los sustratos de
hojas, raquis y bayas de la variedad agronómica Malvasía, así como, corteza de la vid y
suelo, pertenecientes a viñedos del Centro de Desarrollo Vitícola Tropical, ubicado en el
municipio Mara, estado Zulia, Venezuela, de la cosecha correspondiente a mayo 2008, a
aproximadamente 500 m del viñedo está ubicada la bodega del mismo Centro. De un total
de 123 plantas correspondientes a un viñedo de la variedad Malvasía blanca, se
muestrearon aséptica y aleatoriamente los diferentes tejidos (uvas y partes de la planta
Aislamiento e Identificación Molecular de Levaduras Autóctonas en Viñedo de la Variedad Malvasía Blanca
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 49
(hojas, raquis, corteza de árbol y suelo)), colocándolas en bolsas de polietileno, estériles y
selladas inmediatamente con una banda. Las muestras de los diferentes tejidos se
procesaron inmediatamente y por separado, siguiendo las recomendaciones de Sábate et
al. (2002) y Raspor et al. (2006).
2.2. Aislamiento de levaduras
La preparación de las muestras y diluciones respectivas de cada uno de los tejidos de la
vid y suelo asociado al viñedo, muestreados para el análisis microbiológico se realizó de
acuerdo a la Norma COVENIN 1126-89, posteriormente la aplicación de las diluciones en
placas se realizó de acuerdo a la Norma Venezolana COVENIN 1337-90.
2.3. Selección de levaduras
Una vez contadas las levaduras, se seleccionaron al azar de acuerdo a su morfología
colonial contrastante, aislando 20 colonias diferentes de cada sustrato, de acuerdo a Sábate
et al., 2002. Las colonias aisladas se hicieron crecer en agar YEPD a 28 ºC y posteriormente
se preservaron a 4 ºC hasta la futura identificación (Raspor et al., 2006).
2.4. Identificación molecular de las levaduras
Las colonias de levaduras, fueron identificadas a nivel de especies por amplificación y
restricción de una región del rADN de acuerdo a Guillamón et al. (1998) y Esteve-Zarzoso
et al. (1999). Se aplicó también esta técnica molecular estándar a la cepa de referencia de
Saccharomyces cerevisiae ATCC 4921 (American Type Culture Collection) con el fin de
comprobar la eficacia de la técnica.
2.5. Extracción del ADN de las levaduras
Se realizó mediante la técnica propuesta por Querol, Barrio & Ramón (1992), cuyo
fundamento consistió en romper la pared celular y la membrana plasmática y así poder
acceder al núcleo de la célula, seguidamente se rompió la membrana nuclear para dejar
libre el ADN, y por último se protegió el ADN de enzimas que puedan degradarlo y
finalmente para aislarlo se precipitó en alcohol.
2.6. Análisis de restricción de regiones ribosomales (RFLPs) del rADN y ensayos
PCR
La región ribosomal del gen 5.8S y las regiones intergénicas adyacentes ITS1 e ITS2 del
ADN extraído de cada una de las levaduras se sometieron a amplificación por PCR
Dra. María Berradre
et al.
50
(reacción en cadena de la ADN polymerasa) mediante los cebadores ITS1 (5`-TCC GTA
GGT GAA CCT GCG G-3`) e ITS4 (5´TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3´) según el
procedimiento descrito por Guillamón et al. (1998) y Esteve-Zarzoso et al. (1999). Todas
las amplificaciones se ejecutaron en un Sistema PCR GeneAmp 2400 (Applied Biosystems,
Foster City, CA). Los productos amplificados fueron analizados por electroforesis sobre
geles de agarosa al 1,4% p/v en solución amortiguadora TBE (Tris/Borate/EDTA) 1X,
teñidos con bromuro de etidio (Sigma, St. Louis, MI, USA) y visualizados bajo luz UV.
2.7. Digestión con enzimas de restricción
Los productos amplificados obtenidos del ADN amplificado mediante PCR de cada levadura
se digirieron con las endonucleasas de restricción HaeIII, HinfI, CfoI y DdeI (Boehringer
Mannheim, Germany) (Guillamón et al., 1998; Esteve-Zarzoso et al., 1999). La digestión de
los productos amplificados del ADN se analizó por electroforesis sobre geles de agarosa al
3% p/v en solución amortiguadora TBE (Tris/Borate/EDTA) 1X, teñidos con bromuro de
etidio (Sigma, St. Louis, MI, USA) y visualizados bajo luz UV.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Levaduras aisladas e identificadas en sustratos del viñedo de la variedad de
uva Malvasía.
Se aislaron e identificaron un total de 284 colonias de levaduras en el viñedo, 35 en suelo,
43 en corteza, 52 en hojas, 32 en raquis y 122 en bayas (Tabla 1). Se incluye también la
distribución de las especies de levaduras aisladas por sustrato, donde se observa que en
el suelo asociado al cultivo hubo presencia de un 60% Hanseniaspora guillermondii y 40%
Hanseniaspora uvarum, en la corteza 90% Candida sake y 10% Hanseniaspora uvarum, en
hojas estuvo representado en 100% por Rhodotorula mucilagenosa, en raquis 100% por
Aureobasidium pullulans y en las bayas estuvo presente 96% Rhodotorula mucilagenosa y
4% Aureobasidium pullulans. Estos resultados demuestran que en el viñedo están
ampliamente difundidos los géneros Ascomycetos Hanseniaspora, Candida y
Aureobasidium y el género Basdiomycetos Rhodotorula. El viñedo se caracteriza por la
presencia de levaduras con carácter oxidativo más que fermentativo, como son los géneros
Rhodotorula y Aureobasidium (Raspor et al., 2006), los cuales no presentan potencial
enológico por ser levaduras incapaces de fermentar azúcares, también se ha asociado el
género Rhodotorula con el área de viñedos por presentar compuestos carotenoides que lo
Aislamiento e Identificación Molecular de Levaduras Autóctonas en Viñedo de la Variedad Malvasía Blanca
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 51
hacen resistente a las radiaciones solares (Sábate et al., 2002). Cabe destacar, que
Aureobasidium pullulans es un hongo filamentoso que crece como levadura en cultivo y que
ha sido incluido en el grupo de levaduras como “levadura negra”, es considerado como
parte de la microbiota de levaduras en viñedo, ya que está ampliamente difundido en el
mismo (Sábate et al., 2002; Tristezza et al., 2013).
Tabla 1. Frecuencia de aparición de especies de levaduras aisladas de diferentes sustratos del viñedo de la
variedad de uva Malvasía.
SUSTRATO
1
ESPECIE DE LEVADURA
FRECUENCIA
(%)
Suelo
35 colonias
Hanseniaspora guillermondii
60
Hanseniaspora uvarum
40
Corteza de árbol
43 colonias
Candida sake
90
Hanseniaspora uvarum
10
Hojas
52 colonias
Rhodotorula mucilagenosa
100
Raquis
32 colonias
Aureobasidium pullulans
100
Bayas variedad Malvasía,
Cosecha mayo 2008
122 colonias
Rhodotorula mucilagenosa
96
Aureobasidium pullulans
4
1
Los resultados obtenidos son producto de análisis por triplicado.
En el suelo y corteza se observa una amplia presencia de dos géneros de levaduras
Hanseniaspora y Candida, respectivamente, a pesar de ser sustratos con ausencia de
azúcares (Carrascosa, Muñoz & González, 2005), es el medio a través del cual se difunden
las levaduras con carácter fermentativo por efecto del viento e insectos hasta llegar a las
bayas (Sábate et al., 2002) y ser de esta manera las iniciadoras de los procesos de
fermentación espontánea (Raspor et al., 2006), siendo la presencia de la bodega cerca del
viñedo la que pudo influenciar en la existencia de estas levaduras en estos sustratos
(Grangeteau et al., 2015). H. uvarum aislado de suelo, presenta características enológicas
ya que actúa durante los primeros días de fermentación del mosto en vino, aportando
beneficios en el aroma y sabor del vino (Milanovic, Comitini & Ciani, 2013).
En las bayas, se observa presencia abundante del género Basidiomyceto Rhodotorula,
característico de variedades de uvas blancas, coincidiendo con lo reportado por Raspor et
Dra. María Berradre
et al.
52
al. (2006), sin embargo, a diferencia de otras investigaciones (Li et al., 2010; Cordero-
Bueso, Arroyo, Serrano & Valero, 2011) hay ausencia del género Hanseniaspora en las
bayas, lo que puede estar asociado con factores como temperatura, pluviosidad, grado de
maduración de la baya, altitud y uso de fungicidas, que pueden afectar el desarrollo de este
género. La elevada presencia de levaduras oxidativas permite considerarlas como
residentes del viñedo y a las levaduras fermentativas como habitantes transitorios (Sábate,
et al., 2002).
Se corroboró que el ascomyceto A. pullulans estuvo extendido en el viñedo (raquis y bayas)
se considera como residente del mismo y parte de la microbiota (Barrajon et al., 2009). Se
comprobó la ausencia de la levadura S. cerevisiae, con alto potencial enológico en
cualquiera de los sustratos del viñedo, por poseer estos sutratos bajo contenido de
azúcares (Cordero-Bueso et al., 2011).
En la Tabla 2 se presentan los fragmentos de restricción de las especies de levaduras
aisladas en los distintos sustratos del viñedo muestreados.
Tabla 2. Levaduras aisladas e identificación de acuerdo a longitud en pares de base (pb) de la región
amplificada del gen 5.8S-ITS por PCR y fragmentos obtenidos después de la digestión con enzimas de
restricción.
ESPECIE DE
LEVADURA
PRODUCTO
AMPLIFICADO
(pb)
FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN
Hinf I
Hae III
CFoI
Dde I
Rhodotorula
mucilagenosa
640
340+225+75
425+215
320+240+80
---
Hanseniaspora
uvarum
750
350+200+180
750
320+310+105
300+180+
95+90+85
Hanseniaspora
guillermondii
750
350+200+180
750
320+310+105
380+180+
95+80
Aureobasidium
pullulans
600
290+180+100
150+450
190+175+96
---
Candida sake
450
230+220
450
250+200
---
Los productos amplificados obtenidos estuvieron comprendidos entre 450-750 pb y estos
se compararon directamente con los obtenidos en la investigación de Esteve-Zarsoso et al.
(1999), que se encargó de desarrollar una base de datos disponible para un gran número
de especies de levaduras aisladas de alimentos y bebidas. Los productos amplificados
Aislamiento e Identificación Molecular de Levaduras Autóctonas en Viñedo de la Variedad Malvasía Blanca
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 53
fueron digeridos con las enzimas de restricción Hinf I, HaeIII, CfoI y con la enzima DdeI sólo
los géneros de Hanseniaspora, para diferenciar entre dos especies de H. uvarum y H.
guillermondii (Esteve-Zarsoso et al., 1999; Milanovic et al., 2013).
En las Figuras 1, 2 y 3 se presentan patrones de restricción diferentes que después de ser
comparados con las masas moleculares previamente descritas por Esteve-Zarsoso et al.
(1999), se identificaron como Rhodotorula mucilagenosa, Hanseniaspora uvarum,
Hanseniaspora guillermondii, Aureobasidium pullulans y Candida sake. En la Figura 1 se
observan los patrones de restricción de las especies de levaduras Hanseniaspora uvarum
y Rhodotorula mucilagenosa presentes en sustratos como corteza, hoja y bayas.
Las columnas 2 y 8 muestran el fragmento de restricción correspondiente a la especie Hanseniaspora uvarum aislada de corteza.
Las columnas 3-6 y 9-12 corresponden a la especie Rhodotorula mucilagenosa aislada de los sustratos baya y hoja.
Figura 1. Gel de agarosa al 3% p/v representando los fragmentos de restricción con las enzimas Hinf I
y Hae III de dos de las especies aisladas en sustratos de viñedo (corteza, baya y hoja) de la variedad
de uva Malvasía.
En la Figura 2 el género Hanseniaspora (H. uvarum y H. guillermondii) en suelo. En la
Figura 3 Candida saque y Hanseniaspora uvarum en corteza. Estas especies de levaduras
han sido comúnmente aisladas de diversos sustratos del viñedo (Sábate et al., 2002;
Raspor et al., 2006) y considerada parte de la flora de levaduras del mismo en
investigaciones realizadas por Esteve-Zarsoso et al. (1999) y Chavan et al. (2009).
M Hinf I M Hae III M
Pb
1500
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
M: Maracador de 100 pb
Dra. María Berradre
et al.
54
Las columnas 2-19 representan los fragmentos de restricción correspondientes al género Hanseniaspora aislada del suelo del
viñedo.
Figura 2. Gel de agarosa al 3% p/v representando los fragmentos de restricción con las enzimas Hinf
I, Hae III y CfoI de dos de las especies aisladas en el sustrato de viñedo (suelo) de la variedad de uva
Malvasía.
Las columnas 2,10,12-16 muestran el fragmento de restricción correspondiente a la especie Candida saque aislada de corteza.
Las columnas 3 y 11 corresponden a la especie Hanseniaspora uvarum aislada del sustrato corteza.
Figura 3. Gel de agarosa al 3% p/v representando los fragmentos de restricción con las enzimas Hinf
I y Hae III de dos de las especies aisladas en el sustrato de viñedo (corteza) de la variedad de uva
Malvasía.
Pb
1500
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
M Hinf I Hae III CfoI Hinf I Hae III CfoI Hinf I Hae III CfoI Hinf I Hae III CfoI Hinf I Hae III CfoI Hinf I Hae III CfoI
M Hinf I M Hae III M
Pb
1500
1000
900
800
700
600
500
400
300
M: Maracador de 100 pb
M: Maracador de 100 pb
Aislamiento e Identificación Molecular de Levaduras Autóctonas en Viñedo de la Variedad Malvasía Blanca
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 55
4. CONCLUSIONES
En el viñedo se detectó la presencia de cinco especies de levaduras mediante la siguiente
distribución por sustrato del viñedo, en suelo 60% Hanseniaspora guillermondii y 40%
Hanseniaspora uvarum, en la corteza 90% Candida sake y 10% Hanseniaspora uvarum, en
hojas 100% por Rhodotorula mucilagenosa, en raquis 100% Aureobasidium pullulans y en
las bayas 96% Rhodotorula mucilagenosa y 4% Aureobasidium pullulans.
La Técnica molecular PCR-RFLP utilizada, sometiendo los productos amplificados a un
análisis de restricción con las enzimas Hinf I, Hae III, CfoI y DdeI fue eficiente para la
identificación molecular de levaduras en viñedo de la variedad de uva Malvasía.
5. REFERENCIAS
Barrajón, N., Arévalo-Villena, M., Rodríguez-Aragón, L. & Briones, A. (2009). Ecological study of wine yeast
in inoculated vats from La Mancha region. Food Control, 20, 778–783.
Beltrán, G., Torija, M., Novo, M., Ferrer, N., Poblet, M., Guillamón, J., Rozès, N. & Mas, A. (2002). Analysis of
yeast populations during alcoholic fermentation: A sixyear follow-up study. Systematic and Applied
Microbiology, 25, 287-293.
Boynton, P. & Greig, D. (2016). Species richness influences wine ecosystem function through a dominant
species. Fungal ecology, 22,61-72.
Carrascosa, A., Muñoz, R. & González, R. (2005). Microbiología del Vino. Primera edición. Antonio Madrid
Vicente (ed), España.
Chavan, P., Mane, S., Kulkarni, G., Shaikh, S., Ghormade, V., Nerkar, DP., Shouche, Y. & Deshpande, MV.
(2009). Natural yeast flora of different varieties of grapes used for wine making in India. Food Microbiology,
26, 801-808.
Cordero-Bueso, G., Arroyo, T., Serrano, A. & Valero, E. (2011). Influence of different floor management
strategies of the vineyard on the natural yeast population associated with grape berries. International
Journal of Food Microbiology, 148, 23-29.
Esteve-Zarzoso, B., Belloch, C., Uruburu, F. & Querol, A. (1999). Identification of yeast by RFLP analysis of
the 5,8S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacers. International Journal of Systematic
Bacteriology, 49, 329-337.
Francesca, N., Gaglio, R., Alfonzo, A., Settanni, L., Corona, O., Mazzei, P., Romano, R., Piccolo, A. &
Moschetti, G. (2016). The wine: typicality or mere diversity? The effect of spontaneous fermentations and
biotic factors on the characteristics of wine. Agriculture and Agricultural Science Procedia, 8, 769-773.
Grangeteau, C., Gerhards, D., Rousseaux, S., Wallbrunn, Ch., Alexandre, H. & Guilloux-Benatier, M. (2015).
Diversity of yeast strains of the genus Hanseniaspora in the winery environment: What is their involvement
in grape must fermentation?. Food microbiology, 50, 70-77.
Guillamón, J., Sábate, J., Barrio, E., Cano, J. & Querol, A. (1998). Rapid identification of wine yeast species
base on RFLP analysis of the ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region. Archives of Microbiology,
169, 387-392.
Li, S., Cheng, C., Li, Z., Chen, J., Yan, B., Han, B. & Reeves, M. (2010). Yeast species associated with wine
grapes in China. International Journal of Food Microbiology, 138, 85-90.
Milanovic, V., Comitini, F. & Ciani, M. (2013) Grape berry yeast communities: Influence of fungicide treatments.
International Journal of Food Microbiology, 161, 240-246.
Molero, T., Guerrero, R. & Martínez, E. (2007). Caracterización del sistema de producción de uva de vino en
el Municipio Mara, estado Zulia. Venezuela. Revista de la Facultad de Agronomía de la Universidad del
Zulia, 24, 343-366.
Moreira, N., Pina, C., Mendes, F., Couto, J., Hogg, T. & Vasconcelos, I. (2011). Volatile compounds
contribution of Hanseniaspora guillermondii and Hanseniaspora uvarum during red wine vinifications. Food
Control, 22, 662-667.
Norma Venezolana COVENIN 1126-89. (1989). Identificación y preparación de muestras para el análisis
microbiológico. 7 p.
Norma Venezolana COVENIN 1337-90. (1990). Método para recuento de Mohos y Levaduras. 6 p.
Dra. María Berradre
et al.
56
Portillo, MC. & Mas, A. (2016). Analysis of microbial diversity and dynamics during wine fermentation of
Grenache grape variety by high-throughput barcoding sequencing. LWT-Food Science and Technology,
72, 317-321.
Querol, A., Barrio, E. & Ramón, D. (1992). A comparative study of different methods of yeast strain
characterization. Systematic and Applied Microbiology, 15, 439-446.
Raspor, P., Milek, D., Polanc, J., Možina, S. & Čadež, N. (2006). Yeasts isolated from three varieties of grapes
cultivated in different locations of the Dolenjska vine-growing region, Slovenia. International Journal of Food
Microbiology, 109, 97-102.
Sábate, J., Cano, J., Esteve-Zarzoso, B. & Guillamón, J. (2002). Isolation and identification of yeasts
associated with vineyard and winery by RFLP analysis of ribosomal genes and mitochondrial ADN.
Microbiological Research, 157, 267-274.
Sun, H., Ma, H., Hao, M., Pretorius, I. & Chen, S. (2009). Identification of yeast population dynamics of
spontaneous fermentation in Beijing wine region, China. Annals of microbiology, 59, 69-76.
Tristezza, M., Vetrano, C., Bleve, G., Spano, G., Capozzi, V., Logrieco, A., Mita, G. & Grieco, F. (2013).
Biodiversity and safety aspects of yeast strains characterized from vineyards and spontaneous
fermentations in the Apulia Region, Italy. Food microbiology, 36, 335-342.
