Publicación Cuatrimestral. Vol. 3, Año 2018, N

2 (31-60).

ESPECIACIÓN DE SELENIO EN MUESTRAS DE SANGRE Y

PLASMA EN PACIENTES CON LEUCEMIA POR HPLC-ICP-MS

MSc. Jervis Nava

, Dra. Marinela Colina

1,2*

, MSc. Carolina Sthormes

, Dra. Ana

Cáceres

, Lic. Brinolfo Montilla

Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias Departamento de Química, Maracaibo 4011, Zulia,

Venezuela.

Innovación Ambiental Quitosano CA, San Francisco No 29-25, Maracaibo, Zulia, Venezuela.

*Autor para la correspondencia. Email: colinamarinela@gmail.com

Recibido: 22-11-2017 / Aceptado: 21-2-2018

RESUMEN

En el presente trabajo se desarrolló un método de análisis para la determinación de la concentración total de

selenio en muestras de sangre completa y plasma de pacientes con leucemia mediante ICP-MS. Por otro

lado, se desarrolló un método para la determinación de algunas especies de Se en muestras de sangre y

plasma mediante HPLC-ICP-MS. Se emplearon diferentes fases móviles en modo isocrático. La separación

más adecuada para las especies selenio DL cisteína y selenio DL metionina se obtuvieron con una fase móvil

de: 0,1% 2-mercaptoetanol, 3% metanol, 0,06M acetato de amonio y 2mM de EDTA, a una velocidad de flujo

de 1mL.min

-1

. Para selenio total, los límites de detección y cuantificación fueron 0,03 µg.L

-1

y 0,04 µg.L

-1

respectivamente. Las desviaciones estándar relativas (DER) en la corrida y entre corridas fueron de 0,8 %

2,71 % respectivamente, indicando una adecuada precisión en el análisis, adicionalmente con los valores

obtenidos en la recuperación (101,15% ± 1,4) cuya exactitud es aceptable. Las concentraciones medias de

selenio en sangre completa y plasma fueron de 243,6 ± 112,3 y 141,7 ± 34,1 µg.L

-1

respectivamente para

pacientes con leucemia y para la población control fueron de 198,0 ± 40,6 y 159,1 ± 30,1 µg.L

-1

respectivamente Los límites de detección y de cuantificación obtenidos para las especies fueron: 0,46 y 0,47

µg.L

-1

para la selenoDLcisteína y de 0,45 y 0,47 µg.L

-1

para la selenoDLmetionina respectivamente. La

precisión como (DER) fue menor al 5% se encontraron valores adecuados en el proceso de extracción con

recuperaciones entre 95 y 105%. Se encontraron concentraciones de selenoDLcisteína en sangre y plasma

de pacientes con leucemia de 171,25 ± 56,5 y 106,74 ± 11,1 µg.L

-1

respectivamente y para la población control

de 123,77 ± 16,2 y 84,96 ± 6,9 µg.L

-1

Palabras clave: Selenio, sangre, plasma, leucemia, selenoproteínas, selenoaminoácidos, selenoDLcisteína,

selenoDLmetionina.

SELENIUM SPECIATION IN BLOOD AND PLASMA SAMPLES IN

PATIENTS WITH LEUKEMIA BY HPLC-ICP-MS”

ABSTRACT

The concentration of selenium in blood and plasma is the most appropriate magnitude for the valuation of the

corporal content of selenium by means of analytic techniques for sin the for clinical practice. In this research,

an analysis method to determine the total concentration of selenium in whole blood and plasma samples from

patients with leukemia using ICP-MS was carried out. The limits of detection and quantification were 0.03 µg.L

and 0.04 µg.L

-1

respectively. The relative standard deviations in and between runs were 0.8 % 2.71 %

Ciencias

Químicas

Artículo de Investigación

MSc. Jervis Nava y col.

respectively, indicating an appropriate accuracy in the analysis and also with the values obtained in the

recovery (101.15 % ± 1.4) whose accuracy is acceptable. The mean concentrations of selenium whole blood

and plasma were 243.6 ± 112.3 and 141.7 ± 34.1 µg.L

-1

respectively for patients with leukemia and for the

control population were 198.0 ± 40.6 and 159.1 ± 30.1 µg.L

-1

respectively. Furthermore, it was developed a

method for the determination of some species in the same samples, through HPLC-ICP-MS using different

mobile phases with isocratic mode. The most appropriate separation was obtained with a mobile phase of: 0.1

% 2- mercaptoethanol, 3 % methanol, 0,06M ammonium acetate and 2mM of EDTA, with pump speed of

1mL.min

-1

. The detection and quantification obtained were: 0.46 and 0.47 µg.L

-1

for the seleno-DL-cysteine

and 0.45 and 0.47 µg.L

-1

for the seleno-DL-methionine respectively. The accuracy was 5% or even smaller

than that. In the extraction process, recoveries between 95 and 105% were found. There were concentrations

of seleno-DL-cysteine in whole blood and plasma from leukemia patients of 171.25 ± 56.5 and 106.74 ± 11.1

µg.L

-1

respectively and for the control population of 123.77 ± 16.2 and 84.96 ± 6.9 µg.L

-1

Key words: Selenium, blood, plasma, leukemia, selenoproteins, selenoaminoacids, selenoDLcysteine,

selenoDLmetionine.

ESPECIAÇÃO DE SELÊNIO EM AMOSTRAS DE SANGUE E

PLASMA EM PACIENTES COM LEUCEMIA POR HPLC-ICP-MS

RESUMO

A concentração de selênio no sangue e no plasma é a magnitude mais apropriada para a avaliação do

conteúdo corporal do selênio por meio de técnicas analíticas para a prática clínica. Nesta pesquisa, um

método de análise para a determinação da concentração total de selênio no sangue total e nas amostras de

plasma de pacientes com leucemia foram realizadas por medio de ICP-MS. Os limites de detecção e

quantificação foram de 0,03 µg.L

-1

e 0,04 µg.L

-1

, respectivamente. Os desvios-padrão relativos e entre as

replicas foram de 0,8% a 2,71%, respectivamente, indicando uma precisão adequada na análise e também

com os valores obtidos na recuperação (101,15% ± 1,4) com uma acurácia aceitável. As concentrações

médias de selênio no sangue total e no plasma foram de 243,6 ± 112,3 e 141,7 ± 34,1 µg.L

-1

, respectivamente,

para pacientes com leucemia e para a população controle foram de 198,0 ± 40,6 e 159,1 ± 30,1 µg.L

-1

respectivamente. Além disso, foi desenvolvido um método para a determinação de algumas espécies nas

mesmas amostras por medio de HPLC-ICP-MS usando diferentes fases móveis como o modo isocrático. A

separacão mais apropriada foi obtida com uma fase de: 0,1% de 2- mercaptoetanol, 3% de metanol, 0, 06 M

de acetato de e 2 mM de EDTA, com velocidade da bomba de 1 mL.min

-1

. Os limites de detecção e

quantificação obtidos foram: 0,46 e 0,47 µg.L

-1

para a seleno-DL-cisteína e de 0,45 e 0,47 µg.L

-1

para a seleno-

DL-metionina, respectivamente. A precisão como foi de 5% ou menor. No processo de extração foram

encontradas recuperações entre 95 e 105%. Foram concentrações de seleno-DL-cisteína no sangue total e

plasma de pacientes com leucemia de 171,25 ± 56,5 e 106,74 ± 11,1 µg.L

-1

respectivamente e para a

população controle de 123,77 ± 16,2 e 84,96 ± 6,9 µg.L

-1

Palavra chaves: Selênio, sangue, plasma, leucemia, selenoproteínas, selenoaminoácidos,

selenoDLcysteine, selenoDLmetionine.

1. INTRODUCCIÓN

El selenio (Se) es un elemento traza esencial en el cuerpo humano, forma parte importante

de las enzimas antioxidantes que protegen las células contra los efectos de los radicales

libres que se producen durante el metabolismo normal del oxígeno (Casals et al., 2005). En

la última década se han acumulado evidencias que permiten afirmar que los radicales libres

y el conjunto de especies reactivas que se les asocian juegan un papel central en el

equilibrio homeostático, que es el normal funcionamiento de los mecanismos de regulación

Especiación de Selenio en Muestras de Sangre y Plasma en Pacientes con Leucemia por HPLC-ICP-MS

Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 33

que conservan el estado normal fisiológico de los organismos (Avello & Suwalsky, 2006).

Su papel protector en la prevención del cáncer es objeto de intensos debates y estudios

epidemiológicos, existiendo indicios de que esa acción puede ser más farmacológica que

esencial (Vadgama et al., 2000). En el humano, el selenio ha sido reconocido como

elemento esencial en el mantenimiento de las funciones fisiológicas en el organismo que,

a su vez, debe ser ingerido en la dieta humana en concentraciones del orden de 70 μg.día

en el caso de déficit de selenio. Su disminución o aumento de concentración puede

provocar deficiencias o efectos tóxicos. Es por ello que, los efectos beneficiosos del selenio

siempre están relacionados con el contenido de selenoproteínas o enzimas dependientes

de selenio en el organismo (Hernández & Ríos, 2009).

Las fuentes principales del selenio es la ingesta de alimentos que proceden de la dieta

diaria y los suplementos nutricionales enriquecidos con selenio, (Hernández & Ríos, 2009;

Hurtado & Gardea, 2007; Werner, 1992) la forma en que se aportan el selenio en este tipo

de alimento es unido a proteínas (selenoproteínas de baja masa molecular, <10 KDa). En

la estructura de la selenoproteína, tiene uno o varios átomos de selenio que reemplaza el

azufre de los aminoácidos cistina, cisteína y metionina, dando lugar a especies orgánicas

de selenio como selenocistina (SeCys

), selenocisteína (SeCys), selenometionina (SeMet),

metil-selenocisteína (CH

SeCys) y seleno-metil-selenocisteína (SCM) (Avissar, 1989). En

la actualidad, tanto el selenio como sus especies son el objetivo de numerosas

investigaciones en el campo de la salud humana, ya que presentan propiedades

antioxidantes y anticancerígenas (Hernández & Ríos, 2009). El selenio es un agente

químico preventivo efectivo contra el cáncer en muchos animales de experimentación.

Además, estudios epidemiológicos realizados en algunas ciudades han demostrado que el

selenio posee posibles efectos en la prevención del cáncer (Rangel, 2005; Micke et al.,

2009). El selenio presenta varios estados de oxidación, formando gran variedad de

compuestos inorgánicos y orgánicos, siendo su química compleja en el medioambiente y

en los sistemas vivos (Gómez et al., 1999).

Las propiedades tóxicas y esenciales del selenio dependen no sólo del nivel de

concentración sino también de la forma química en que esté presente. Por lo tanto, la

biodisponibilidad, actividad biológica, transporte, distribución y efectos tóxicos de este

elemento traza en los organismos vivos dependerá en gran parte de su especie química

(Gómez et al., 1999). Actualmente está claramente establecida la necesidad de la

determinación, no solo de la cantidad total de un elemento en una muestra, sino de las

distintas especies químicas en que se encuentra distribuido ese elemento en dicha muestra

(especiación). La especiación química permite establecer la distribución geoquímica del

MSc. Jervis Nava y col.

elemento en el medioambiente, su biodisponibilidad y/o toxicidad en los distintos

organismos vivos y seres humanos. El análisis de especies inorgánicas y orgánicas en

suplementos alimenticios, así como de muestras biológicas, es de gran interés para definir

rutas metabólicas y prevenir enfermedades muy extendidas. Estos procedimientos

analíticos requieren la aplicación de técnicas analíticas de última generación para la

identificación y cuantificación de especies elementales (Gómez et al., 1999; Hernández,

2010; Kelly, Paramee, Patrick, & Zoltán, 2018).

Selenio en la leucemia

La disminución en la concentración sérica de selenio se considera un factor de riesgo de

enfermedades cardiovasculares, cáncer, cirrosis hepática y distrofia muscular. La

importancia de este mineral como micronutriente, radica en que se asocia con el sitio activo

de la Glutatión Peroxidasa (GSH-PX) y esta enzima protege al cuerpo de los peróxidos

nocivos que son producto del metabolismo. La acumulación de peróxidos puede conducir

a la generación de radicales libres, que a su vez destruyen membranas y son causa de

cáncer y aterosclerosis.

En el presente trabajo se persigue la determinación de selenio total, así como algunas

especies químicas presentes en muestras de sangre y plasma de pacientes con leucemia

mediante la técnica cromatografía líquida de alta resolución acoplado en línea con

espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (HPLC-ICP-MS).

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1. Reactivos

Los reactivos químicos empleados fueron de grado certificado o analítico. La solución

concentrada de selenio (ca. 1000 mg Se.L

-1

) se preparó gravimétricamente a partir de

selenito de sodio (Na

SeO

) (Merck). Las soluciones patrones de plomo se prepararon

diariamente por dilución serial de la solución concentrada del analito. El rango de

concentraciones empleado para la técnica de espectrometría de masa con plasma

acoplado inductivamente (ICP-MS) para la determinación analítica del selenio fue: 5, 10,

20 y 40 µg Se.L

. Estos patrones se prepararon a partir de soluciones intermedias (ca.

100, 10 y 1 mg Se.L

), cuyas concentraciones se evaluaron por ICP-MS. Todas las

soluciones fueron preparadas con agua bidestilada y desionizada en ácido nítrico (HNO

al 2% v/v). Se emplearon matraces volumétricos de vidrio tipo A de 10, 25, 50, 100, 250 y

500 mL (Pyrex o Kimax) para preparar las soluciones, y envases de polietileno lineal

Especiación de Selenio en Muestras de Sangre y Plasma en Pacientes con Leucemia por HPLC-ICP-MS

Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 35

(Nalgene) de 125, 250 y 500 mL para almacenar las soluciones concentradas, intermedias,

patrones acuosos de las especies de selenio estudiadas y para las diluciones de las

muestras requeridas para al análisis espectrométrico.

Para el tratamiento de muestras de sangre completa y plasma se emplearon: Hidróxido de

amonio (NH

OH) (Alba Aesor), Peróxido de hidrógeno (H

al 30% v/v) (Riedel de Häen),

1-octanol (Riedel de Haën) y agua bidestilada y desionizada.

Para extraer el selenio para determinarlo por HPLC-ICP-MS se usaron, como agentes

complejantes del selenio en forma de aminoácidos o proteínas: L-cisteína (C

SNO

0,05% m/v) marca (Merck, 99%), en una solución de ácido clorhídrico (HCl al 0,1% v/v)

(Riedel de Haën, 37% M), 2-mercaptoetanol (C

SO al 0,1% v/v). (Merck, 99%). La

solución extractante fue preparada con agua grado HPLC (Ricca Chemical Company,

ACS).

Para las separaciones cromatográficas de las especies de selenio se utilizaron como

reactivos patrones: Seleno-DL-cisteína (Sigma, 79%) y seleno-DL-metionina (Fluka

Biochemika, 99%). El rango de concentraciones empleado para la técnica de HPLC-ICP-

MS para la especiación de selenio fue: 5, 10, 15 y 20 µg Se.L

. Estos patrones se

prepararon a partir de soluciones intermedias (i.e. 100 y 1 mg Se.L

) en agua grado HPLC.

Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA 2 mmolL-1) (Riedel de Haën, 99%), 2-

mercaptoetanol (C

SO al 0,1 % v/v), Acetato de amonio (NH

COO 0,06 M) (Merck,

98%) y metanol (CH

OH al 3% v/v), Grado HPLC (Merck) como fase móvil. se Como fase

móvil 0.1% de Ácido Fórmico (Merck, 99%), metanol al 1% y agua grado HPLC.

2.2. Equipos

Se utilizó un equipo ICP-MS Agilent Technologies Serie 7500. Las condiciones del equipo

ICP-MS se representan en la tabla 1. La separación de las especies de selenio se realizó

mediante un cromatógrafo HPLC marca Agilent Technologies serie 1200 equipado con una

bomba de automuestreado de volumen variable modelo ASX-500 Series, una columna

analítica Zorbax eclipse XDB-C18 de 150 mm de longitud x 4,6 mm de diámetro interno.

2.3. Muestreo

La recolección de las muestras de sangre completa se realizó a través de un muestreo al

azar de pacientes con leucemia (PL, n=35) y suministradas por el Instituto Hematológico de

Occidente (IHO), Maracaibo, Venezuela. También se recolectaron muestras de individuos

sanos (población control, PC, n=5), con jeringas desechables, las muestras se colocaron

MSc. Jervis Nava y col.

en tubos de propileno tapados a presión que contenían 0,1 mL de sal disódica de EDTA al

10% como anticoagulante por cada 4,5 mL de sangre.

Tabla 1. Condiciones de trabajo optimizadas en HPLC-ICP-MS para la separación y cuantificación de

algunas especies de selenio en sangre competa y plasma.

Parámetros de ICP-MS

Datos

Potencia (Rf)

1400W

Nebulizador

Concéntrico

Velocidad de la bomba del nebulizador (rpm)

0,4

Flujo del plasma (L.min

-1

)

14,5

Flujo de gas de arrastre (L.min

-1

)

0,9

Flujo de gas de enfriamiento (L.min

-1)

0,17

Isótopo monitoreado

Método de adquisición de la data

Spectrum

Parámetros de HPLC

Columna

Fase móvil

Ácido fórmico, metanol, agua

Composición de la fase móvil

0,1%, 1%, 98,9%

Caudal de flujo

1,3 mL.min

-1

Modo de elución

Isocrático

Volumen de inyección

50 µL

Método de adquisición de la data

Análisis de tiempo de resolución

Columna

Fase Móvil

2-Mercaptoetanol, acetato de amonio, EDTA, metanol

Composición de la fase móvil

0,1%, 0,06M, 2mM, 3%

Caudal de flujo

1 mL.min

-1

Modo de elución

Isocrático

Volumen de inyección

50 µL

Método de adquisición de la data

Análisis de tiempo de resolución

2.4. Metodología analítica

La metodología desarrollada para la determinación de las concentraciones de algunas

especies de Se utilizando HPLC-ICP-MS se optimizó evaluando los parámetros de mérito

analítico. Los límites de detección (LD) fueron calculados a partir de las curvas de

calibración correspondientes a cada especie en estudio (Miller & Miller, 2002). La precisión

del método, expresada como la desviación estándar relativa (%DER) en la corrida y entre

corrida, se obtuvo a partir de cinco determinaciones de una muestra real. Por su parte, la

exactitud se evaluó preparando disoluciones de concentración conocida y adicionadas a

una muestra de sangre completa y se inyectaron en el sistema cromatográfico para así

obtener el porcentaje de recuperación.

La sensibilidad se estudió por medio de las curvas de calibración y de esta manera poder

determinar qué tan sensible resulto el método para cada una de las especies consideradas

en estudio; para ello se utilizó la siguiente ecuación: (1)

Donde de S es la sensibilidad; dy es el diferencial de las señales y dC el diferencial de las

concentraciones (Cámara et al., 2004).

2.5. Procedimientos

Especiación de Selenio en Muestras de Sangre y Plasma en Pacientes con Leucemia por HPLC-ICP-MS

Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 37

2.5.1. Tratamiento de las muestras de sangre completa y plasma para la

determinación de selenio total

Las muestras de sangre completa se centrifugaron a aproximadamente 5500 rpm durante

15 min para obtener el plasma y las células sanguíneas por separado, luego se empleó

digestión en medio básico para la mineralización de las muestras para sangre completa y

plasma. Para esto se utilizó un volumen de 0,5 mL de sangre y plasma con volúmenes

variables de (NH

OH 1 M y 2 M), H

al 30% v/v y 20 µL de 1-octanol (aprox. 2 gotas)

como antiespumante. Esto se realizó en matraces abiertos en un ambiente de baja

temperatura para evitar pérdidas del analito por volatilización. Las muestras se dejaron

estabilizar por aproximadamente 24h hasta la mineralización total de las mismas, finalmente

se transfirieron a matraces volumétricos que se aforaron a 10 mL con agua desionizada.

Los blancos se prepararon con los mismos reactivos, pero en ausencia de la muestra bajo

las mismas condiciones de mineralización.

2.5.2. Determinación de la concentración total de selenio en las muestras de

sangre y plasma

La determinación de la concentración total de Se en las muestras de sangre y plasma una

vez digeridas se llevó a cabo mediante la espectrometría de masas con plasma acoplado

inductivamente (ICP-MS), utilizando curvas de calibración elaboradas con patrones

acuosos en ácido nítrico al 2% v/v. Estos patrones se prepararon cada vez que se realizaron

las determinaciones analíticas y fueron preparados a partir de soluciones intermedias

partiendo de una solución de 1000 mg Se.L

-1

del isótopo de 82Se (Peacheya et al., 2009).

2.5.3. Especiación química de selenio en muestras de sangre completa por HPLC-

ICP-MS

Para la metodología de extracción de las especies de selenio por HPLC-ICP-MS, se

tomaron 250µL de sangre completa y se colocaron en tubos de polipropileno con 4,75 mL

de una solución que contenía: HCl al 0,1% v/v; L-cisteína al 0,05% m/v y 2-mercaptoetanol

al 0,1% v/v. La mezcla fue colocada en un baño de ultrasonidos (1400 A Maraca LR) por

15min. Las soluciones resultantes fueron centrifugadas a 5000 rpm durante 10 min y

posteriormente filtradas antes de la inyección en el cromatógrafo HPLC. (Colina, 2001;

Rodriguez et al., 2009).

La separación y cuantificación de las especies de selenio se realizó mediante HPLC-ICP-

MS en las cuales se evaluaron dos fases móviles diferentes:

MSc. Jervis Nava y col.

Método 1: Bajo la modalidad de fase reversa para especies orgánicas (SelenoDLcisteína y

SelenoDLmetionina) utilizando como fase móvil: 0.1% de Ácido Fórmico, metanol al 1% y

agua grado HPLC, utilizando un flujo de elución de 1.3 mL.min

-1

en modo isocrático y una

columna C18 en fase reversa (Hernández, 2010).

Método 2: Se utilizó EDTA 2 mM, 2-mercaptoetanol 0,1%, acetato de amonio 0,06 M y

metanol al 3% en agua, y una columna C18 en fase reversa. La separación cromatográfica

de Se-DL-Cys y Se-DL-Met se realizó en modo isocrático empleando un volumen de

inyección de muestra de 50 µL y un flujo de elución de 1.00 mL.min

-1

(Colina, 2001).

El acoplamiento HPLC-ICP-MS se realizó por conexión entre la salida de la columna

analítica y el nebulizador a través de un tubo capilar de PTFE (politetrafluoretileno) de 30

cm de longitud y 0,5 mm de diámetro interno.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Evaluación de los parámetros analíticos para selenio total

La técnica de espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS)

goza de un amplio reconocimiento como técnica principal para el análisis de metales traza.

Proporciona una sensibilidad muy por encima de la que proporciona la técnica ICP-OES y

una velocidad de análisis de muestras muy superior a la de los instrumentos de absorción

atómica con cámara de grafito. El ICP-MS cumple ambos requisitos en un rango de trabajo

analítico más amplio, además de añadir capacidades de análisis isotópico, sin interferencias

y en un único modo de adquisición. El procedimiento ICP-MS combina la eficiencia en la

descomposición de las muestras para formar iones con la potencia de la espectrometría de

masas para distinguir iones de masas diferentes, ofreciendo una gran detectabilidad en la

determinación de selenio y otros elementos, pudiendo incluso realizar estudios de

especiación. Otro avance importante es la posibilidad de cuantificar individualmente cada

uno de los isótopos del selenio, por lo que se considera un método ideal para el estudio del

metabolismo utilizando isótopos estables de este metaloide en el plasma, eritrocitos, y orina

(Wilbur, 2007; Amy, Rosen & Hieftje, 2005; Umesh et al., 2017).

3.1.1. Curva de calibración

Especiación de Selenio en Muestras de Sangre y Plasma en Pacientes con Leucemia por HPLC-ICP-MS

Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 39

La curva de calibración obtenida a partir de las soluciones patrones de Se cuyo intervalo de

concentraciones estuvo entre 5,0 – 20,0 µg Se.L

-1

. obteniéndose una buena linealidad y

cumplimiento de la Ley de Beer, por lo tanto, la calidad de la determinación de la

concentración de Se aceptable debido a la excelente capacidad de respuesta del ICP-MS

para establecer la señal medida proporcional a la concentración de Se en términos de

sensibilidad.

En la tabla 2 se muestran los parámetros estadísticos asociados a la curva de calibración

empleada en la determinación de la concentración total de Se. Estos valores evidencian la

solidez de esta herramienta analítica basado en el manejo estadístico de la data, lo cual

permite su uso en la cuantificación del analito en estudio.

También se muestran los límites de detección (L

, calculado como la concentración

correspondiente a tres veces la desviación estándar del blanco) y de cuantificación (L

calculado como la concentración correspondiente a diez veces la desviación estándar del

blanco) ( Miller & Miller, 2002) y la sensibilidad instrumental (S, calculado como la pendiente

de la curva de calibrado a la concentración objeto de estudio) la cual fue de 661,47. Estos

resultados indican la alta sensibilidad de la técnica de ICP-MS y los bajos límites de

detección para el análisis de muestras de sangre completa y plasma sanguíneo en

pacientes diagnosticados con leucemia.

Tabla 2. Parámetros estadísticos asociados a la curva de calibración de Se.

Metal

Ecuación de regresión

I.L.

(µg.L

-1

)

(µg.L

-1

)

(µg.L

-1

)

DE de la

pendiente

DE del

intercepto

y= 661,47x – 4,177

0,999

5,0-20,0

0,03

0,04

0,39

0,051

n=3,

Coeficiente de correlación,

Intervalo lineal, DE = Desviación estándar.

3.2. Estudio de interferencias no espectrales

El estudio de interferencias no espectrales fue realizado comparando las pendientes de la

curva de calibración, en matriz de ácido nítrico al 2% v/v, con aquellas obtenidas por el

método de adición estándar para las diferentes matrices evaluadas.

La figura 1 muestra las curvas de adición estándar obtenidas para la determinación de

selenio en muestras de sangre completa de pacientes con leucemia por ICP-MS con

respecto a la curva de calibración, observándose el excelente paralelismo entre las gráficas

allí expresadas y por consiguiente la inexistencia de interferencias no espectrales en este

tipo de matriz, además se obtuvieron porcentajes de error entre pendientes menores a

(5,0%) los cuales se expresan en la tabla 3 cuya media de los porcentajes fue de 3.03%,

en tal sentido, se encontraron ecuaciones para las curvas de adición estándar

estadísticamente similares (p ≤ 0,05) a las de las curvas de calibración. Este hecho refuerza

MSc. Jervis Nava y col.

el uso de las curvas de calibración para la determinación de selenio en sangre completa de

pacientes con leucemia.

Figura 1. Curvas de adición estándar y calibración para la determinación de Se total en sangre completa.

Tabla 3. Parámetros de regresión obtenidos de las adiciones estándar para la determinación de Se total en

muestras de sangre completa.

Adición

estándar

Ecuación de

regresión

Coeficiente de

correlación (r)

% Error entre

pendientes

y = 630,64 x + 2845,4

0,998

4,66

y = 681,57 x + 3271,3

0,998

3,04

y = 670,59 x + 3818,7

0,997

1,38

n=3

Estos resultados indican que no existen efectos de matriz, siendo el método libre de

interferencias del tipo no espectral y puede ser aplicado para la determinación de la

concentración total de selenio por ICP-MS en este tipo de muestra.

3.3. Precisión

El estudio de precisión del método desarrollado para la determinación de Se en sangre

completa y plasma sanguíneo de pacientes con leucemia, se realizó en muestras reales

diluidas (Tabla 4). Estos resultados de precisión en la corrida y entre corridas son

expresados como media (X, en μg Se.L

-1

), desviación estándar (DE, en μg Se.L

-1

) y

desviación estándar relativa o coeficiente de variación (DER o CV, en %), obtenidos para

la determinación de Se por ICP-MS.

Los experimentos se realizaron en tres alícuotas de cada una de las muestras reales y las

determinaciones de Se total en estas porciones de prueba se hicieron por pentaplicado. Los

resultados obtenidos señalan que la DER promedio fue de 0,8 % y 2,71 %, para la precisión

en la corrida y entre corridas respectivamente, y fueron menores al 5,0 % lo cual

internacionalmente se considera adecuado para este tipo de análisis (Sierra et al., 2009).

-2000

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

-10 -5 0 5 10 15 20 25

Intensidad (CPS/Counts)

Concentración de Se (µg/L)

Curva de calibración

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Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 41

3.4. Exactitud

Los resultados obtenidos en la evaluación de la exactitud para la determinación de Se total,

se expresan en la tabla 6. La exactitud se evaluó mediante un estudio de recuperación

(método de adición estándar), adicionando concentraciones conocidas de Se a muestras

de sangre completa de pacientes con leucemia (mineralizadas). En la tabla 5 se muestran

los valores esperados y los valores encontrados en la evaluación de la exactitud mediante

estudios de recuperación (método de adición estándar) expresados como la media de los

porcentajes (%) de recuperación para una muestra mineralizada y determinada por ICP-

MS. Se obtuvieron valores analíticamente aceptables a nivel internacional (Sierra et al.,

2009) encontrándose en un intervalo entre el 95 y 105%, que indican que el método

desarrollado estuvo libre de interferencias fue confiable y reproducible, por lo tanto, es

adecuado para la determinación de Se total en muestras de sangre.

Tabla 4. Estudios de precisión en la corrida y entre corridas para la determinación de Se total en muestras

de sangre completa por ICP-MS.

Muestra

Media X (µg.L

-1

)

En la corrida

Entre corridas

DE (µg Se.L

-1

)

DER (%)

DE (µg Se L

-1

)

DER (%)

4,51

0,007

0,15

0,009

0,22

4,81

0,062

1,29

0,296

6,16

5,69

0,055

0,96

0,099

1,75

Tabla 5. Estudio de exactitud para la determinación de Se total en muestras de sangre completa mineralizadas

por ICP-MS usando el método de adición estándar.

Adicionado

(µg.L

-1

)

Esperado

(µg Se.L

-1

)

Encontrado

(µg Se.L

-1

)

Recuperado (%)

9,70

9,86

101,64

13,70

13,64

99,56

17,70

18,10

102,26

101,15 ± 1.4

3.5. Optimización del tratamiento de las muestras de sangre completa y plasma

Para la determinación de las concentraciones totales de Se en sangre completa y plasma

sanguíneo de pacientes con leucemia por IPC-MS, es necesario tener el analito libre en

solución, por lo que se debe tratar la muestra con métodos factibles que permitan obtener

MSc. Jervis Nava y col.

al analito libre, es por ello, que se llevó a cabo una digestión en medio básico con hidróxido

de amonio y peróxido de hidrógeno con un volumen constante de muestra (0,5 mL) y

variando el volumen de agente oxidante (H

conc.), volumen y concentración de base

(NH

OH, 1 M y 2M). Dado que dicho tratamiento genera un exceso de espuma debido a la

degradación de la materia orgánica presente en las muestras de sangre que imposibilita la

adecuada dilución de la misma, se utilizó 20 µL de 1-octanol como agente antiespumante.

En la tabla 6 se resumen los volúmenes de dichos reactivos (H

/NH

OH), utilizados para

la determinación de Se total en sangre completa. Se buscaba maximizar la concentración

de Se total en sangre completa, para ello, se utilizaron diferentes combinaciones de

volúmenes de (H

/NH

OH) y modificando la concentración de base para el tratamiento.

Se observó que los diferentes volúmenes utilizados no afectaba significativamente en la

determinación de la concentración de Se total en la muestra de sangre (p > 0,05) para una

misma concentración de base, pero si entre diferentes concentraciones de base (NH

OH,

1M y 2M). La diferencia fue estadísticamente significativa (p < 0,05), para un límite de

confianza del 95%. Se establecieron como volúmenes óptimos, 4 mL para H

conc. y 2

mL para NH4OH 1 M, los cuales mejoraron la detección de Se total, buscando un menor

consumo de reactivo, minimizar costos y toxicidad. Las mismas condiciones se adaptaron

para el tratamiento de plasma.

Tabla 6. Volúmenes de NH

OH y H

en la digestión de las muestras de sangre completa (n=3) (*p < 0,05).

Concentración

(mol.L

-1

)

Volumen (mL) de

/NH

OH)

Concentración de Se

(µg.L

-1

)

X ± DE

4/2

270,6 ± 3,6

4/4

204,6 ± 1,7*

6/2

260,4 ± 6,0

6/4

207,8 ± 8,3

4/2

239,6 ± 3,3

4/4

143,9 ± 3,1*

6/2

203,1 ± 1,6

6/4

193,5 ± 2,6

3.6. Concentraciones totales de Se en muestras de sangre y plasma de

pacientes con leucemia

La metodología validada se empleó para establecer las concentraciones totales de Se para

35 pacientes con leucemia clasificados por edad y sexo, expresados en la tabla 7.

Especiación de Selenio en Muestras de Sangre y Plasma en Pacientes con Leucemia por HPLC-ICP-MS

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Tabla 7. Concentraciones totales de Se en sangre completa de pacientes con leucemia.

Grupo

(años)

Sexo

Concentración de Se (µg.L

-1

)

X ± DE

Intervalo

1–19

284,7 ± 151,0

59,2 - 588,5

276,3 ± 104,6

78,6 - 356,7

20–40

261,9 ± 95,4

165,3 - 356,1

164,4 ± 57,5

103,6 - 217,8

41–60

294,0 ± 117,7

208,3 - 458,9

237,9 ± 45,6

205,7 - 270,1

61–80

226,1 ± 68,5

147,2 - 270,6

155,1 ± 36,4

129,4 - 180,8

Las concentraciones de Se en sangre completa de los pacientes en estudio variaron de

acuerdo a la edad, encontrándose mayor contenido de Se total en pacientes con edades

comprendidas de (1–19) y de (41–60) que para el resto de la población, sin embargo, no

existieron diferencias significativas para estos grupos de edades (p ≤ 0,05) ni para el resto

de la población. De forma general, se encontraron mayores concentraciones de Se total en

la población masculina que en la femenina tanto para sangre como para plasma y no se

encontraron diferencias estadísticamente significativas (p ≤ 0,05) de que la concentración

de Se total varíe con el sexo de la población en estudio, debido a la forma en la que el Se

ingresa al organismo a través de los alimentos, por lo que va depender en gran parte de

una adecuada alimentación, ya que los niveles de Se en el organismo varían con la

alimentación (Navarro & Cabrera, 2008).

La concentración de selenio en el plasma (o suero) está relacionada con la ingesta y

responde de forma relativamente rápida. Dentro de una misma población, los niños tienen

concentraciones más bajas que los adultos. Al nacer, el selenio plasmático es de un 40 a

un 70% del valor maternal decreciendo su concentración durante los 4 primeros meses de

vida, y elevándose gradualmente, hasta alcanzar los valores de un adulto en los últimos

años de la adolescencia. La concentración en sangre y en eritrocitos es aproximadamente

un 15% y un 37%, respectivamente, más elevada que en el plasma (Casals et al., 2005).

Cabe destacar que los productos derivados de cereales, carne, huevos y pescado son las

fuentes de selenio principales de la dieta. Los niveles dependen de la clase de alimento y

de la concentración y accesibilidad del selenio del suelo en el que se cultivan las plantas,

por lo que los valores de selenio varían considerablemente (Navarro & Cabrera, 2008).

3.7. Concentraciones totales de selenio en muestras de sangre completa y

plasma de pacientes con leucemia (PL) e individuos controles (PC)

MSc. Jervis Nava y col.

En la tabla 8 se muestran las concentraciones de Se de pacientes con leucemia para

sangre completa (PL, n = 35) y plasma (PL, n = 5) y de 5 individuos sanos que conformaron

la población control (PC, n = 5). Para las concentraciones de Se en sangre completa y

plasma de pacientes con leucemia y la población control, no se encontraron diferencias

estadísticamente significativas (p ≤ 0,05) entre las concentraciones de Se total. Se

encontraron concentraciones de Se mayores en sangre completa y plasma de los pacientes

que en la población control. Estadísticamente hasta ahora tanto las concentraciones de Se

en sangre y plasma de PL y PC resultaron ser idénticas y este elemento no guarda relación

con la enfermedad de la leucemia.

Sin embargo, un análisis total del elemento es insuficiente para conocer su papel biológico

en esta patología por lo que se necesitarán llevar a cabo estudios de especiación y evaluar

algunas de las especies de Se presentes en las muestras de sangre y plasma de pacientes

con leucemia y conocer la biodisponibilidad de las mismas y su relación con la patología.

Tabla 8. Concentraciones de Se total encontradas en pacientes con leucemia (PL, n = 35) para sangre

completa, (PL, n = 5) para plasma y población control (PC, n = 5). (P>0,05).

Población

Muestra

Concentración de Se (µg.L

-1

)

X ± DE

243,6 ± 112,3

141,7 ± 34,1

198,0 ± 40,6

159,1 ± 30,1

SC = Sangre completa, P = Plasma.

Granadillo (2009) encontró valores de concentración media de Se total (g.L

-1

) en muestras

de sangre completa de pacientes con leucemia del Instituto Hematológico de Occidente (n

= 32): 218,4  45,6 los cuales se compararon con las concentraciones encontradas en la

población en estudio, resultando ser más bajas, para una media (g.L

-1

) de la población en

estudio (n = 35): 243,6  112,3. Sin embargo, no se encontraron diferencias

estadísticamente significativas (p > 0,05), tomando en cuenta que la población estudiada

por Granadillo fueron pacientes con leucemia de la ciudad Maracaibo Edo. Zulia y los

pacientes bajo estudio pertenecen a la ciudad de Barquisimeto Edo. Lara, los cuales

pueden estar sometidos a una dieta especial a base de Se para cubrir las funciones

metabólicas normales de este elemento traza en el organismo, a través de la dieta diaria

y/o como posible suplemento para tratar la enfermedad.

Van et al., 2007 establecieron los niveles de Se en plasma de donadores sanos del banco

de sangre de la parte central-este de Bélgica (79,7 ± 4,4 ng.L

-1

) y otros países de Europa

Especiación de Selenio en Muestras de Sangre y Plasma en Pacientes con Leucemia por HPLC-ICP-MS

Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 45

tales como: Francia (75,8 ± 2,4 ng.L

-1

), Alemania (106,5 ± 16,5 ng.L

-1

), Portugal (98 ± 16

ng.L

-1

), España (74,7 ± 25,2 ng.L

-1

) y Eslovenia (66 ± 15 ng.L

-1

Las medidas más habituales de la exposición humana a selenio son el contenido de selenio

de la sangre completa, suero o plasma. La fracción de sangre que se elige para el análisis

depende de las circunstancias. El plasma y el suero reflejan los cambios en la ingesta de

selenio de manera más rápida que los eritrocitos. Puede ser posible utilizar los niveles de

selenio en plasma para valorar la concentración a corto plazo y el selenio de los eritrocitos

y la sangre completa para reflejar la concentración a largo plazo. Esta atribución puede

explicarse por el hecho de que el selenio está enlazado en los eritrocitos de manera estable

y la vida media de los eritrocitos es de unos 120 días. Las concentraciones en los eritrocitos

se mantienen proporcionales a la ingesta diaria de selenio. A concentraciones más altas, la

capacidad de transporte del plasma llega a saturarse y los eritrocitos soportan todo el

incremento de este elemento (Schaller & Schiele, 2006).

La variación de la concentración de Se total en sangre y plasma se debe a la alimentación.

El contenido de Se en el alimento depende de la zona geográfica y de la relación suelo

planta, por lo tanto, en zonas donde la dieta sea baja en Se los niveles en sangre y plasma

disminuirán y viceversa. Entre otras fuentes de variación de Se, se encuentra la edad, la

raza y la época del año. Actualmente en la práctica clínica, es importante el seguimiento de

las concentraciones de selenio en el plasma en pacientes a los que se les considera

proclives padecer una deficiencia de este elemento como consecuencia de una

enfermedad, una terapia, o una ingesta deficiente y/o crónica, por lo que la concentración

de selenio en el plasma valora de una forma adecuada el contenido corporal de selenio en

el organismo (Schaller & Schiele, 2006)

3.8. Especiación química de selenio por HPLC-ICP-MS

En relación a los sistemas de detección utilizados para realizar estudio de especiación se

encuentran: las técnicas de espectrometría atómica (AAS, ICP-OES) y la de masa ICP-MS.

La técnica ICP-MS se utiliza para identificar compuestos desconocidos, cuantificar

compuestos conocidos, y para elucidar la estructura y propiedades químicas de moléculas,

además ofrece mejores límites de detección (Cáceres, 2002; Cabañero et al., 2005).

El selenio forma parte de enzimas que cumplen funciones importantes en el organismo, y

es por ello que hoy en día es de interés determinar además del selenio total, también son

importantes algunas especies orgánicas de este elemento como los selenoaminoácidos

que constituyen parte de las selenoproteínas. En tal sentido, en el presente trabajo se

enfocó en las dos especies orgánicas de selenio (SeDLCys y SeDLMet) más importantes,

MSc. Jervis Nava y col.

las cuales participan en procesos biológicos esenciales y las de mayor biodisponibilidad en

el organismo (Tabla 9). Para este fin, se requiere de una técnica de separación como la

cromatografía líquida en combinación con una técnica de espectrometría de masas. En esta

investigación se realizó el acoplamiento HPLC con detección por ICP-MS

Tabla 9. Estructuras de las especies orgánicas de selenio en estudio (Rayman, 2009).

NOMBRE

ESTRUCTURA

SELENODLCISTEÍNA

SELENODLMETIONINA

3.8.1. Optimización de las condiciones cromatográficas

Una vez realizado el acoplamiento HPLC-ICP-MS y establecidas las condiciones para la

detección de los selenocompuestos en estudio, se inició la optimización de la separación

de los selenoaminoácidos, para ello se emplearon diferentes fases móviles. Con la finalidad

de identificar las especies en estudio, estándares en un intervalo de 5-100 µg.L

-1

inyectaron individualmente para conocer el tiempo de retención de cada especie.

Posteriormente se preparó una mezcla compuesta por selenoDLcisteína y

selenoDLmetionina a una concentración de 20 µg.L

-1

para cada especie y se inyectaron en

el sistema cromatográfico para observar la separación de estos compuestos. En este caso,

se lograron obtener señales de poca intensidad, por esta razón, se incrementó la

concentración a 100 µg.L

-1

, sin embargo, la señal observada resultó ser poco intensa. En

la figura 2 se muestra el cromatograma para una mezcla de patrones de 100 µg.L

-1

por

especie, utilizando inicialmente como fase móvil: 0,1% ácido fórmico, 1% de metanol y

98,9% de agua grado HPLC, con una velocidad de flujo de 1,3 mL.min

-1

y con un volumen

de inyección de 50 µL, la cual fue seleccionada de la literatura (Hernández, 2010). En el

cromatograma se puede observar que existe una buena resolución en el sistema

cromatográfico, por lo tanto, una buena separación de las especies de selenio. Así se tiene,

que para la especie de SelenoDLcisteína (SeDLCys) se obtuvo un tiempo de retención de

1,96 min y para la selenoDLmetionina (SeDLMet) un tiempo de 3,08 min.

Especiación de Selenio en Muestras de Sangre y Plasma en Pacientes con Leucemia por HPLC-ICP-MS

Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 47

Figura 2. Cromatograma de la SeDLCys y SeDLMet a una concentración de 100 µg.L

-1

, condiciones:

Volumen de inyección: 50 μL. Velocidad de flujo: 1,3 mL.min

-1

. Columna C

. Fase móvil: 0,1% de ácido

fórmico, 1% metanol.

El pH de la fase móvil influye en esta modalidad cromatográfica sobre el grado de ionización

del analito. Un aumento o disminución del mismo favorece o desfavorece la ionización del

analito y por lo tanto su retención en la fase estacionaria.

Con la finalidad de reducir los tiempos de retención y aumentar la intensidad de las señales

cromatográficas para las especies de selenio en estudio, se procedió a preparar una mezcla

compuesta por SeDLCys y SeDLMet a una concentración de 20 µg.L

-1

para cada especie

en agua grado HPLC y se inyectaron en el sistema cromatográfico, empleando una segunda

fase móvil, la cual estuvo compuesta por 0,06 mM de acetato de amonio, 3% de metanol,

0,1% de 2-mercaptoetanol y 2 mM de EDTA, utilizando un volumen de inyección de 50 μL,

con una velocidad de flujo de 1,0 mL.min

-1

y una columna C18. La cual fue seleccionada de

la literatura (Colina, 2001).

En la figura 3 se representa el cromatograma de una mezcla de SeDLCys y SeDLMet con

una concentración de 20 µg/L por especie. Se puede observar que en este caso también

existe una buena resolución en el sistema cromatográfico. Con el empleo de esta fase (Fase

móvil: 0,1% 2-mercaptoetanol, 0,06M de acetato de amonio, 2mM de EDTA y 3% de

metanol), se obtiene una mayor intensidad de las señales cromatográficas para las

especies de selenio en estudio, así como una disminución en los tiempos de retención de

las especies en comparación con la fase móvil empleada inicialmente, obteniéndose

tiempos de retención para la SeDLCys y SeDLMet de 1,52 y 2,11 min respectivamente.

Entre los modificadores más comunes utilizados se encuentran el metanol (MeOH), etanol

(EtOH) y el acetonitrilo (ACN). De igual forma se reporta el uso de agentes que pueden

controlar la ionización del analito tales como ácidos orgánicos, entre los cuales se

encuentran el ácido acético (HAc), el ácido fórmico (HCO

H) y el ácido

MSc. Jervis Nava y col.

etilendiaminotetracético (EDTA). En general, estos últimos se emplean a bajas

concentraciones para disminuir el poder ionizante del analito y reducir la retención en la

fase estacionaria, además, actúan como fuente de protones y mejoran la forma de la señal

cromatografica (Quattrocchi, Abelaira, Laba, 1992). El aumento del porcentaje de metanol

por encima de 3%, no afecta a los tiempos de retención de las especies estudiadas; sin

embargo, provoca un leve ensanchamiento de los picos correspondientes a las especies

orgánicas, empeorando la resolución cromatográfica. Por otro lado, el aumento en la

cantidad de disolvente orgánico ejerce un efecto reductor en la señal de selenio por ICP-

MS. En vista de los resultados, se decidió seguir trabajando con un porcentaje de un 3% de

metanol para el resto de los experimentos como lo reporta la literatura. Por su parte, el pH

de la fase móvil se encontraba entre 6–7,5 a temperatura ambiente.

Figura 3. Cromatograma de la SeDLCys y SeDLMet a una concentración de 20 µg.L

-1

, condiciones:

Volumen de inyección: 50 μL. Velocidad de flujo: 1,0 mL.min

-1

. Columna C

Al aumentar el pH de la fase móvil se produce una reducción en los tiempos de retención

de las especies de selenio, hecho que es mucho más marcado para la especie

SelenoDLmetionina. A pH ácidos próximos a 2, los grupos carboxílicos de los aminoácidos

se encuentran protonados, confiriendo a las moléculas una carga neta positiva (debido al

grupo –NH

), mientras que a pH superiores adquieren la forma de zwitterión. Esto podría

explicar la reducción de la retención de las especies a pHs superiores, donde la carga

negativa del grupo carboxilato interactúa con la fase estacionaria por repulsiones

electrostáticas, y de esta manera acortando los tiempos de retención de las especies de

selenio en estudio, junto con una reducción en la anchura de sus picos.

En las tablas 10 y 11 se observan los valores de los parámetros cromatográficos tales

como: tiempo de retención, factor de retención, número de platos teóricos, factor de

selectividad y resolución de la columna para cada fase móvil empleada.

Especiación de Selenio en Muestras de Sangre y Plasma en Pacientes con Leucemia por HPLC-ICP-MS

Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 49

Los resultados de la resolución (Rs) muestran también un grado de separación correcta de

las especies ya que presentan valores por encima de 1,5, del mismo modo los resultados

en cuanto al factor de selectividad (α) demuestran que esta resultó efectiva para la

separación de los selenocompuestos corroborando la eficiencia de la separación

cromatográfica.

Tabla 10. Parámetros cromatográficos para la separación de selenoaminoácidos estudiados a una

concentración de 100 μg.L

-1

utilizando una columna C

, fase móvil: 0,1% ácido fórmico, 1% metanol y 98,9%

agua a un flujo de 1,3 mL.min

-1

(n=3)

Especie

Tiempo de

retención

(min)

Factor de

retención

(k')

Número de platos

teóricos

(N)

Factor de

selectividad

(⍺ )

Resolución

(Rs)

SeDLCys

1,96

2,32

784

1,82

3,85

SeDLMet

3,08

4,22

1936

En la tabla 11, empleando una fase móvil de 0,1% 2-mercaptoetanol, 3% metanol, 0,06M

acetato de amonio y 2mM EDTA a un flujo de 1,0 mL/min, se observan que los valores del

factor de retención (k’) y los cortos tiempos de retención demuestran una elución eficiente

en términos de tiempo de análisis, indicando un menor tiempo de permanencia de los

analitos en la fase estacionaria y en la fase móvil, los cuales son adecuados para la

separación ya que se encuentran entre un intervalo ideal entre 2 y 10. El valor de la

resolución (Rs) muestra también un grado de separación correcta de las especies ya que

presentan valores por encima de 1,5 lo cual indica los cortos tiempos de elución de las

especies en el análisis, de igual forma los resultados en cuanto al factor de selectividad (α)

demuestran que también resultó ser efectiva para la separación de los selenocompuestos,

indicando la buena eficiencia de la separación cromatográfica.

De acuerdo a los resultados obtenidos, el empleo de ambas fases móviles resultaron por lo

general ser adecuadas para la separación de las especies de selenio exhibiendo factores

de retención adecuados, cortos tiempos de análisis, y buena resolución en las

separaciones. No se encontraron diferencias significativas en términos de selectividad

cromatográfica para las fases empleadas. En tal sentido, la mezcla de 0,1% de 2-

mercaptoetanol, 3% de metanol, 0,06M de acetato de amonio y 2mM de EDTA utilizada

como fase móvil, permitió la separación adecuada de las dos especies de selenio, con una

buena resolución en la separación, tiempos de retención más cortos, picos más definidos y

señales cromatográficas más intensas, por lo que se tomo como las condiciones óptima de

trabajo para el análisis de especiación de selenio en muestras de sangre completa y plasma

de pacientes con leucemia.

MSc. Jervis Nava y col.

Tabla 11. Parámetros cromatográficos para la separación de selenoaminoácidos estudiados a una

concentración de 20 μg.L

-1

utilizando una columna C

, fase móvil: 0,1% 2-mercaptoetanol, 3% metanol,

0,06M acetato de amonio y 2mM EDTA a un flujo de 1,0 mL.min

-1

(n=3)

Especie

Tiempo de

retención

(min)

Factor de

retención

(k')

Número de platos

teóricos

(N)

Factor de

selectividad

(⍺ )

Resolución

(Rs)

SeDLCys

1,52

2,04

591

1,57

2,11

SeDLMet

2,11

3,22

741

3.9. Evaluación de los parámetros analíticos

3.9.1. Curvas de calibración

Una vez optimizadas las condiciones para la separación de los selenocompuestos

estudiados se prepararon las respectivas curvas de calibración. En la tabla 12 se muestran

las ecuaciones de regresión, los intervalos lineales, coeficientes de correlación lineal,

límites de detección y cuantificación para cada especie.

Cabe mencionar que los límites de detección (L

) y cuantificación (L

) fueron calculados a

partir de cinco determinaciones de una disolución patrón de menor concentración, ya que

la señal procedente del blanco no era discernible de la línea base del cromatograma. La

concentración de esta disolución fue de 0,5 µg.L

-1

de Se por especie. Para ambas especies

la linealidad fue buena obteniéndose bajos límites de detección, sin embargo, la especie

selenoDLcisteína resulto ser menos sensible que la especie selenoDLmetionina reflejada

en una menor pendiente de curva

Tabla 12. Parámetros estadísticos asociados a la curva de calibración de los selenocompuestos.

Especie

Ecuación de regresión

I.L.

(µg.L

-1

)

(µg.L

-1

)

(µg.L

-1

)

DE de la

pendiente

DE del

intercepto

SeDLCys

y= 213,47x + 19,496

0,995

5,0-20,0

0,46

0,47

3,15

0,53

SeDLMet

y= 312,77x + 35,048

0,991

5,0-20,0

0,45

0,47

2,57

0,46

n=3,

Coeficiente de correlación,

Intervalo lineal, DE = Desviación estándar.

La sensibilidad instrumental (S, calculado como la pendiente de la curva de calibrado a la

concentración objeto de estudio para la selenoDLcisteína fue de 213,47 mientras que para

la selenoDLmetionina fue de 312,77. Estos resultados indican la buena sensibilidad de la

técnica de HPLC-ICP-MS, siendo más sensible en la detección la especie

selenoDLmetionina.

3.9.2. Precisión

Especiación de Selenio en Muestras de Sangre y Plasma en Pacientes con Leucemia por HPLC-ICP-MS

Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 51

Para el estudio de precisión del método desarrollado para la determinación de las especies

de Se en muestras de sangre completa y plasma sanguíneo de pacientes con leucemia, se

evaluó mediante una muestra de sangre preparada por triplicado la cual se inyectó en el

sistema cromatográfico y leída por pentaplicado.

En la tabla 13 se representan los resultados de precisión en la corrida y entre corridas los

cuales son expresados como (desviación estándar, DE) y (desviación estándar relativa,

DER) para una muestra cuya especie contenía selenoDLcisteína. Los resultados obtenidos

señalan que la DER promedio fue de 1,58 % y 2,46 %, para la precisión en la corrida y entre

corridas respectivamente, las cuales fueron menores al 5,0% indicando que el método por

HPLC-ICP-MS es reproducible, lo que internacionalmente se considera adecuado para este

tipo de análisis. Cabe señalar que las inyecciones de muestras en el cromatógrafo HPLC

se hacen de forma automatizada, evitando así errores aleatorios o sistemáticos por parte

del analista.

Tabla 13. Estudios de precisión en la corrida y entre corridas para la determinación de selenoDLcisteína en

una muestra de sangre completa por HPLC-ICP-MS.

Muestra

Concentración de

selenoDLcisteína

(µg.L

-1

)

En la corrida

Entre corridas

DER (%)

4,09

0,058

1,42

0,073

1,78

4,13

0,045

1,09

0,121

2,92

4,40

0,098

2,23

0,118

2,68

n=3

3.9.3. Exactitud

La exactitud se evaluó mediante un estudio de recuperación, adicionando 3 niveles de

concentraciones conocidas de la especie selenoDLcisteína a una muestra de sangre

completa mineralizada. Los resultados obtenidos en la evaluación de la exactitud para la

determinación de la especie de selenio por HPLC-ICP-MS, se expresan en la tabla14.

En la tabla 14 se muestran los valores esperados y los valores encontrados en la evaluación

de la exactitud mediante estudios de recuperación expresados como la media de los

porcentajes (%) de recuperación para una muestra de sangre conteniendo la especie

selenoDLcisteína. Se obtuvieron valores aceptables a nivel internacional, encontrándose

en un intervalo entre el 95 y 105%, que indican que el método desarrollado fue confiable,

reproducible y adecuado para la determinación de selenocompuestos en muestras de

sangre y plasma utilizando HPLC-ICP-MS.

MSc. Jervis Nava y col.

Tabla 14. Estudio de exactitud para la determinación de SelenoDLcisteína en una sangre completa

mineralizada determinado por HPLC-ICP-MS.

Muestra

Concentración de

selenoDLcisteína

(µg.L

-1

)

Adicionado

(µg.L

-1

)

Esperado

(µg.L

-1

)

Encontrado

(µg.L

-1

)

(%)

Recuperación

Sangre

4,09

14,09

13,91

98,72

24,09

23,69

98,34

44,09

43,84

99,43

98,83 ± 0,6

3.9.4. Evaluación del Proceso de Extracción

Como inicialmente se hicieron inyecciones directas de muestras de sangre mineralizadas

las cuales presentaron poca intensidad en las señales cromatográfica como se muestra en

la figura 4, lo que demuestra la bajas concentraciones en las que se encuentran los

selenocompuestos en la muestra, que este caso solo se evidenció la presencia de la

especie selenoDLcisteína, por lo que se procedió a realizar una extracción de las muestras

de sangre completa con una solución que contenía L-cisteína al 0,05% m/v, ácido

clorhídrico al 0,1% v/v y 2-mercaptoetanol al 0,1% v/v. La solución extractante fue

preparada con agua grado HPLC, como así lo reporta la literatura (Colina, 2001).

Figura 4. Cromatograma de una muestra de sangre completa mineralizada.

Es importante resaltar que la extracción empleada para la especiación de selenio en

muestras de sangre completa y plasma en una técnica de pretratamiento de la muestra, lo

cual resulta muy importante para la obtención de las especies en estudio, a partir de una

matriz compleja como lo es la sangre. Las especies deben formar una molécula neutra y

estable con un agente acomplejante específico para que pueda lograrse la extracción

cuantitativa de los analitos bajo estudio (Granadillo, 2009). En consecuencia, solo la

especie química selenoDLcisteína pudo ser evaluada y detectada mediante el uso de esta

extracción en fase líquida, por lo que luego de la extracción de las muestras de sangre

Especiación de Selenio en Muestras de Sangre y Plasma en Pacientes con Leucemia por HPLC-ICP-MS

Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 53

completa en forma de la especie selenoDLcisteína, la solución resultante fue inyectada en

el sistema cromatográfico y de este modo evaluar la eficiencia de la extracción.

En la tabla 15 se muestran los resultados de la recuperación de la especie selenoDLcisteína

utilizando una solución de L-cisteína al 0,05% m/v, ácido clorhídrico al 0,1% v/v y 2-

mercaptoetanol al 0,1% v/v a pH= 6–7, para evaluar el proceso de extracción en la

determinación de selenocompuestos por HPLC-ICP-MS. Para ello, se adicionaron

concentraciones conocidas del estándar de selenoDLcisteína a la muestra de sangre antes

del proceso de extracción con la solución antes mencionada hasta un volumen final de 5

mL, obteniéndose recuperaciones analíticamente aceptables dentro del intervalo permitido

de 95–105 %, resultando el proceso de extracción confiable, reproducible y adecuado para

la determinación de selenoDLcisteína en muestras de sangre completa.

Tabla 15. Estudio de recuperación del proceso de extracción de la especie SelenoDLcisteína en una sangre

completa.

Muestra

Concentración de

selenoDLcisteína

(µg.L

-1

)

Adicionado

(µg.L

-1

)

Esperado

(µg.L

-1

)

Encontrado

(µg.L

-1

)

(%)

Recuperación

Sangre

6,22

26,22

26,06

99,39

46,22

47,31

102,35

56,22

58,49

104,03

101,92 ± 2,3

En general, el proceso de extracción como pretratamiento de las muestras de sangre

completa para el análisis de especiación de selenio, resulta satisfactorio en comparación

con muestras de sangre mineralizadas previamente, sin embargo, en ambos casos la

muestra necesita un tratamiento previo que permita sacarle el mayor provecho en el análisis

cuantitativo de las especies de selenio bajo estudio. Cabe mencionar que el proceso de

extracción utilizando la solución de L-cisteína al 0,05% m/v, ácido clorhídrico al 0,1% v/v y

2-mercaptoetanol al 0,1% v/v resulta ser selectivo para la especie selenoDLcisteína debido

a que químicamente intervienen una serie de reacciones que permitió analíticamente

cuantificarla exitosamente, en dicho proceso de extracción ocurre lo siguiente:

La cisteína [HO

CCH(NH

)CH

SH] es un α-aminoácido no esencial, lo que significa que

puede ser sintetizado por los humanos. La parte de la cadena donde se encuentra la

cisteína es el tiol que es no polar y por esto la cisteína es un aminoácido hidrofóbico, de allí

su disolución en medio ácido. La parte tiol de la cadena suele participar en reacciones

enzimáticas, actuando como nucleófilo. El tiol es susceptible a la oxidación para dar lugar

a puentes disulfuros derivados de la cisteína que tienen un importante papel estructural en

muchas proteínas. La cisteína también llamada cistina, se trata de un dímero de dos

MSc. Jervis Nava y col.

cisteínas a través de un puente disulfuro (S-S) (Johannson, Gafvelin & Arnér, 2005;

Rodriguez et al., 2009).

Ahora bien, al entrar en contacto la solución que contiene L-cisteína de alguna manera

interactúa con el selenio presente en la sangre completa desplazando los átomos de azufre

para convertirse en selenocisteína, y todas aquellas proteínas presentes en la sangre que

no interactúan con la cisteína, ahora reaccionan con el 2-mercaptoetanol presente en la

solución, por medio de la ruptura de los puentes disulfuro (S-S), la estructura terciaria así

como la estructura cuaternaria de algunas proteínas presentes en la sangre (como la

cisteína o cistina). Si una proteína consta de varias cadenas polipeptídicas distintas o

iguales unidas mediante puentes disulfuro (S-S), como es el caso de la cistina, la acción

del 2-mercaptoetanol separa las cadenas polipeptídicas en un proceso de desnaturalización

de las proteínas, convirtiéndolas en moléculas de cisteína que pueden seguir interactuando

con el selenio presente en la sangre hasta agotarse las reservas del mismo, y finalmente

se extrae como la especie de selenocisteína o selenoDLcisteína para su análisis

cuantitativo (Rodriguez et al., 2009; Knight, Wiley & Sons, 2004).

3.9.5. Análisis de muestras reales

El método se aplicó a muestras de sangre completa (n= 5) y plasma (n= 5) de de pacientes

con leucemia (PL) y de igual número de muestras de sangre y plasma a personas

voluntarias consideradas como la población control (PC). En todos los casos o matrices

analizadas, solo se evidenció la presencia de una especie con un tiempo de retención (1,44

± 0,02 min), que según los datos obtenidos para los selenocompuestos corresponde a la

especie selenoDLcisteína. En la (Figura 5, a y b) se presentan los cromatogramas

correspondientes a una muestra de sangre completa y de plasma de pacientes con

leucemia respectivamente.

La presencia de selenoDLcisteína está influenciada por la ingesta o el consumo de

alimentos ricos en selenio como el pescado, granos, mariscos, entre otros. Esta especie es

muy importante para el humano, ya que este aminoácido forma parte de algunas proteínas

esenciales como la glutatión peroxidasa. Además, la identificación y cuantificación de la

SelenoDLcisteína proporciona información sobre la concentración de esta especie en el

organismo, que se puede utilizar como herramienta útil en la prevención y diagnóstico de

enfermedades (Johannson et al., 2005).

Especiación de Selenio en Muestras de Sangre y Plasma en Pacientes con Leucemia por HPLC-ICP-MS

Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 55

Figura 5. Cromatogramas de muestras de sangre completa (a) y plasma (b) de pacientes con leucemia para

la especie SelenoDLcisteína, obtenidos por HPLC-ICP-MS. Columna C

. Fase móvil: 0,1% 2-

mercaptoetanol, 3% metanol, 0,06M acetato de amonio y 2mM EDTA a un flujo de 1,0 mL.min

-1

3.9.6. Relación entre las concentraciones de selenio total y las concentraciones

de la especie selenodlcisteína en muestras de sangre y plasma de pacientes

con leucemia y población control obtenidas mediante el acoplamiento

HPLC-ICP-MS.

En la tabla 16 se expresan las concentraciones individuales de selenio total y las

encontradas para la especie selenoDLcisteína en muestras de sangre y plasma de

pacientes con leucemia y los individuos control.

Tabla 16. Concentraciones individuales de selenio total y concentraciones de selenoDLcisteína en muestras

de sangre y plasma de pacientes con leucemia y población control.

Población

Muestra

Concentración de Se total

(µg.L

-1

)

Concentración de SeDLCys

(µg.L

-1

)

Sangre

320,3

286,5

210,1

264,6

217,8

242,6

175,4

106,7

207,3

124,3

Plasma

171,6

168,4

116,7

124,4

102,1

123,1

112,7

103,6

97,6

96,8

Sangre

222,1

123,1

242,4

140,9

134,7

127,0

199,5

130,5

191,5

97,4

Plasma

155,2

91,8

202,2

91,9

125,1

80,1

173,5

84,7

139,6

76,2

MSc. Jervis Nava y col.

Se observa que las concentraciones de selenio total tanto para los pacientes con leucemia

como para los individuos controles resultaron ser mayores a las concentraciones de la

especie selenoDLcisteína tanto en sangre como en plasma. Estos resultados tienen lógica

si consideramos que en sangre completa y el plasma la especie selenoDLcisteína no es la

única especie presente sino que existen otras especies que cumplen papeles esenciales y

enzimáticos en el organismos, sin embargo, la especie selenoDLcisteína es una de las

especies de selenio con mayor biodisponibilidad en el organismo proporcionada por la

ingesta de alimentos con alto grado de proteínas como lo son los alimentos de origen animal

(e.g., pollo, reses, huevos) (Casals et al., 2005).

3.9.7. Concentraciones de la especie selenoDLcisteína en muestras de sangre y

plasma de pacientes con leucemia y población control obtenidas mediante

HPLC-ICP-MS.

En la tabla 17 se muestran las concentraciones de la especie selenoDLcisteína (media ±

1DE) de pacientes con leucemia para sangre completa (PL, n = 5) y plasma (PL, n = 5) y

de 5 individuos sanos que conformaron la población control (PC, n = 5). Para las

concentraciones de de la especie selenoDLcisteína en sangre completa de pacientes con

leucemia y la población control, no se encontraron diferencias significativas (p > 0,05) entre

las concentraciones de esta especie. La media en sangre completa de (PL) resultó superior

a la media en sangre de la (PC). Por lado se encontraron diferencias estadísticamente

significativas (p < 0,05) entre las concentraciones de selenoDLcisteína para plasma de (PL)

y (PC). En general, se encontraron concentraciones de selenoDLcisteína mayores en

sangre completa y plasma de los pacientes con leucemia que en la población control.

Es importante resaltar que la concentración de la especie selenoDLcisteína tanto en plasma

de pacientes como en la población control son diferentes, esto justifica el hecho de que los

pacientes en estudio se encuentran bajo una dieta especifica o tratamiento con selenio para

tratar la enfermedad de la leucemia, por otra parte la presencia de esta especie en plasma

de los pacientes resulta favorable en el tratamiento de la patología, ya que la especie

selenoDLcisteína cumple importantes papeles enzimáticos y antioxidantes junto a la

selenoproteína glutatión peroxidasa (GPx) para reducir los peróxidos, protegiendo así las

membranas y otras estructuras celulares de la acción de los mismos y evitar así la oxidación

de las células que puedan conllevar a la aparición de este tipo de cáncer, ya que se ha

comprobado que a una concentración mayor de selenio (ca. 40 µg.día

-1

) en sangre y plasma

aumenta la actividad de la glutatión peroxidasa en el plasma, aumentando la eficacia de

Especiación de Selenio en Muestras de Sangre y Plasma en Pacientes con Leucemia por HPLC-ICP-MS

Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 57

esta selenoproteína para combatir este tipo de cáncer en la sangre. Además, el selenio

contribuye a la respuesta inmune, garantiza una función correcta del sistema

endocrinológico e inmunológico (Casals et al., 2005; Hernández, 2007).

Tabla 17. Concentraciones de la especie selenoDLcisteína encontradas en muestras de sangre completa y

plasma de pacientes con leucemia, (PL) y población control (PC).

Población

Muestra

Concentración de selenoDLcisteína (µg/L)

P valor

X ± DE

Intervalo

171,25 ± 56,5

106,7 – 242,5

< 0,05

106,74 ± 11,1

96,8 – 123,1

< 0,05

123,77 ± 16,2

97,4 – 140,9

< 0,05

84,96 ± 6,9

76,2 – 91,9

< 0,05

n=5, SC= Sangre completa, P= Plasma.

Como se ha dicho, las formas de selenio más biodisponibles en la dieta son los

selenoaminoácidos: la selenometionina y la selenocisteína. La selenometionina procede de

fuentes vegetales y animales, mientras que la selenocisteína proviene principalmente de

fuentes animales. Las formas inorgánicas (selenatos y selenitos) los cuales no se

determinaron en este trabajo, contribuyen poco al aporte diario de este elemento en

condiciones normales y sólo adquieren importancia cuando son utilizadas como

suplementos en dietas experimentales o en determinadas situaciones como en los

pacientes sometidos a nutrición parenteral durante un periodo largo de tiempo (Casals et

al., 2005).

Aunque la selenometionina no puede ser sintetizada en el organismo, es posible obtenerla

de la dieta. Sin embargo, es considerada como un reservorio poco regulado de selenio. El

organismo hace uso de este almacén cuando se interrumpe la ingesta de selenio. Aunque

se han sugerido otras funciones de este complejo, actualmente no se conoce que la

selenometionina tenga una función fisiológica importante en el organismo. Por otra parte,

el selenio se absorbe bien por el tracto gastrointestinal, se sabe que más del 90% de la

selenometionina, forma principal de la dieta, se absorbe por el mismo mecanismo. La

selenometionina puede almacenarse en un almacén proteico (se incorpora en las proteínas

aleatoriamente en lugar de metionina) es por ello que en el presente estudio no se obtuvo

indicios de que esta especie esté presente en sangre o plasma de las poblaciones bajo

estudio (Casals et al., 2005; Johannson et al., 2005).

En contraste, la selenocisteína constituye la forma biológicamente más activa y está

estrechamente regulada. Es la forma en la que se encuentra el selenio formando parte de

las selenoproteínas y, al contrario que la selenometionina, no hay evidencia que la

selenocisteína substituya a la cisteína. De hecho, el 80% del selenio se incorpora a las

selenoproteínas en forma de selenocisteína. Sin embargo, se conoce poco sobre el

MSc. Jervis Nava y col.

mecanismo de absorción de la selenocisteína. Tras la absorción, el selenio circula en el

plasma unido principalmente a la selenoproteína P (contiene una tercera parte del selenio

plasmático) y la selenoproteína W (contiene una sexta parte del selenio plasmático),

hallándose el resto unido principalmente a la albúmina de forma no específica, como otros

muchos micronutrientes. La biodisponibilidad de selenio depende de la absorción intestinal

y de su conversión en una forma biológicamente activa. Las evaluaciones de la

biodisponibilidad de selenio se basan en que, tras la absorción, la conversión a formas

biológicamente activas difiere en las distintas formas químicas de selenio. Las diferentes

formas de selenio siguen rutas metabólicas distintas (Casals et al., 2005).

La selenometionina puede almacenarse en un almacén proteico. El catabolismo de este

almacén liberará selenio en forma de selenuro. La selenocisteína no se almacena, sino que

es catabolizada directamente a partir de la cisteína y el selenio resultante forma otra reserva

de selenio. Las formas inorgánicas (selenito y selenato) se almacenan directamente en

forma de selenuro, el cual, independientemente de su origen, se utiliza para la formación

de selenofosfato, precursor de la selenocisteína, que formará parte de las selenoproteínas.

El exceso de selenio es excretado. Si las células precisaran de los depósitos de

selenometionina, ésta sería liberada por proteólisis, aunque, según algunos autores, la

cantidad de selenio disponible en el organismo desde el almacén de selenometionina está

en función del metabolismo de la metionina independientemente de la necesidad de selenio

del organismo (Casals et al., 2005; Rayman, 2009).

4. CONCLUSIONES

La metodología empleada basada en la técnica de ICP-MS, para la determinación de las

concentraciones totales de Se en muestras de sangre completa y plasma de pacientes con

leucemia presentaron valores adecuados de precisión, exactitud y detectabilidad,

constituyéndose una herramienta analítica poderosa para la interpretación clínica de los

valores de Se exhibidos por la población experimental estudiada.

La concentración de selenio total en sangre completa o plasma proporciona la indicación

más completa de ingesta alta o baja de selenio.

Las concentraciones de selenio en plasma o suero varían según la localización geográfica

de la población.

Especiación de Selenio en Muestras de Sangre y Plasma en Pacientes con Leucemia por HPLC-ICP-MS

Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 59

Los estudios de recuperación demostraron una alta eficiencia en la extracción de la especie

SelenoDLcisteína con un porcentaje de recuperación dentro del intervalo permisible

analíticamente.

Los métodos desarrollados basados en la cromatografía líquida de alta resolución acoplado

en línea con la espectrometría de masa con plasma acoplado inductivamente (HPLC-ICP-

MS) para la determinación cualitativa y cuantitativamente en la especiación química de

selenio (i.e., selenoDLcisteína y selenoDLmetionina) en matrices acuosas sencillas y

muestras reales fueron precisos y exactos, libres de interferencias y permitieron la

determinación rápida de las especies estudiadas.

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