Publicación Cuatrimestral. Vol. 2, N
o
2, Año 2017 (1-18)
EXTRACCIÓN DE QUITINA UTILIZANDO ÁCIDO LÁCTICO
Dra. Marinela Nazareth Colina Rincón
1,2*
, Lic. Karen Dianne Medina Robles
1
, Ing.
Jose Alejandro Vargas Colina
2
, MSc. Dianela Isabel Rincón Prieto2, Lic. Rossana
Arismendi2, Lic. Brinolfo Montilla
1
1
Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. Departamento de Química. Laboratorio de Química
Ambiental. Maracaibo 4011. Zulia. Venezuela.
2
Empresa INNOVACION AMBIENTAL QUITOSANO CA. Av 4 San Francisco No 29-25. Zulia, Venezuela.
*
Autor para la correspondencia. E-mail: colinamarinela@gmail.com
Recibido: 15-5-2017 / Aceptado: 14-8-2017
RESUMEN
En este trabajo, se evaluó la extracción de quitina a partir de desechos de crustáceos involucrando la
fermentación láctica generando ácido láctico para la desproteinización y desmineralización del material,
usando suero de leche y azúcar como sustrato y fuente de carbono, por un periodo de 2 y 3 semanas a
temperatura ambiente. Los resultados mostraron que la concentración óptima de azúcar para la extracción de
quitina de un 10% m/v, evidenciando un descenso del pH y consecuente aumento de la acidez total titulable.
Al incrementar el tiempo de fermentación de 2 a 3 semanas, los procesos de desmineralización y
desproteinización mejoraron dando como resultado un porcentaje de ceniza de 2,68% el cual indica una buena
remoción de minerales presentes en los desechos de crustáceos. Además, el porcentaje de remoción resultó
de un 96,62% para el magnesio (Mg
2+
), 95,62% de potasio (K
+
) y 92,82% de calcio (Ca
2+
). El espectro de
FTIR mostró las bandas de los grupos funcionales característicos de la quitina.
Palabras clave: Desechos de crustáceos, quitina, azúcar, suero de leche, fermentación.
CHITIN EXTRACTION USING LACTIC ACID
ABSTRACT
In this work, the extraction of chitin from crustacean waste involving lactic acid fermentation was studied, this
generating lactic acid as product of deproteinization and demineralization of the material. Milk serum and sugar
as substrate and carbon source were used, for a period of 2 y 3 weeks at room temperature. The results
showed that the optimal sugar concentration for chitin extraction was 10% m/v, evidencing a decrease in pH
and a consequent increase in titratable total acidity, by increasing the fermentation time of 2 to 3 weeks. The
results were better with a percentage of ash of 2.68%, indicating a good removal of minerals present in
crustacean wastes. In addition, the percentage of removal resulted in a 96.62%, the rate of removal for
magnesium (Mg
2+
), 95.62% potassium (K
+
) and 92.82% of calcium (Ca
2+
). The FTIR spectrum revealed the
bands from the functional groups that characterize chitin.
Key words: Crustacean wastes, Chitin, Sugar, Buttermilk, fermentation.
Artículo de Investigación
Ciencias
Químicas
Dra. Marinela Nazareth Colina Rincón y col.
2
1. INTRODUCCIÓN
La quitina (poli-β-(1,4)-N-acetil-D-glucosamina) es un polisacárido de importancia, que se
encuentra distribuida en la naturaleza y es uno de los polímeros más abundantes y de fácil
obtención (Larez 2006; Rinaudo 2006; Duarte y col., 2002).Es el segundo polisacárido más
abundante después de la celulosa, y un tipo de recurso natural renovable, que presenta
propiedades como biocompatibilidad, biodegradabilidad y actividad no tóxica. (Colina y col.,
2014). Es uno de los componentes principales de las paredes celulares de los hongos y del
exoesqueleto de crustáceos e insectos (Hernandez y col., 2009; Jakymec y col., 2001). El
contenido de quitina en crustáceos es entre 2-12% del total de su masa corporal (Ayala y col.,
2014).
La extracción de quitina a partir del caparazón de crustáceos se lleva a cabo mediante un
tratamiento químico que se realiza en dos etapas consecutivas: 1) Desproteinización, la cual
consiste en tratar los caparazones de los crustáceos con una solución acuosa diluida de
hidróxido de sodio a temperatura alta con el fin de disolver la proteína 2) Desmineralización,
que se realiza empleando soluciones diluidas de ácido clorhídrico a temperatura de 20
o
C.
(Ayala y col., 2014). Por otro lado, los efluentes de la industria lechera, como lo es el suero
de leche, es un fuerte contaminante para sistemas ecológicos acuáticos, debido a que
poseen una alta demanda bioquímica de oxígeno (Carrilo 2006). Lo que genera un gran
impacto ambiental ya que, en muchos casos, no se tiene un buen sistema de recolección o
deposición del mismo. Sin embargo, para un buen aprovechamiento de este desecho se
puede implementar la fermentación acido láctica. Una fermentación ácido láctica involucra el
uso de bacterias del ácido láctico (Lactobacilo o Lactobacillus) (Hernandez y col., 2009)
siendo un género de bacterias Gram positivas, capaces de convertir la lactosa y azúcares en
ácido láctico.
En relación a lo antes expuesto, en este trabajo se propone la extracción usando un
procedimiento amigable para el medio ambiente de la quitina partiendo de desechos de
crustáceos utilizando ácido láctico; producto de una fermentación ácido láctica usando suero
de leche y azúcar, contribuyendo al aprovechamiento de los desechos tanto de la industria
láctea como camaronera o cangrejera.
La quitina es un biopolímero considerado a menudo como un derivado de la celulosa, la
quitina es blanca, insoluble, dura, inelástica y es obtenida generalmente por un tratamiento
químico y posee una gran masa molecular (Juárez 2010; Belandria, J.; Morillo, N., 2008;
Parada y col., 2004; López 2009; Mármol y col., 2009). La quitina está compuesta por
Extracción de Quitina Utilizando Ácido Láctico
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 3
residuos de N-acetil-D-glucosamida, unidos por enlaces β-(1, 4) (Figura 1). Cuenta con tres
diferentes formas cristalográficas: α-, β- y γ-quitinas.
Figura 1. Estructura de la quitina.
Comparando la abundancia natural de las estructuras polifórmicas, se encuentra que la α-
quitina es la más abundante y estable, mientras que las otras dos se presentan en pequeñas
proporciones y tienden a ser transformadas en α-quitina (Juárez 2010; Larez 2003; Crini
2005; Percot y col., 2003). Aunque muchos métodos se pueden encontrar en la literatura para
la eliminación de las proteínas y minerales de los crustáceos, el método químico utiliza para
eliminar las proteínas de la muestra, una solución de NaOH (1–10%) a temperaturas entre
65 y 100 ºC durante un período de 1 a 24 horas (desproteinización), la eliminación del
carbonato de calcio utiliza un tratamiento ácido con soluciones diluidas de HCl, aunque
también se han utilizado otros ácidos como H
2
SO
3
, HNO
3
, CH
3
COOH, HCOOH
(desmineralización) (Perentena y col., 2015). La quitina resultante es desacetilada, si la
quitina es desacetilada en más de un 50% se produce el quitosano.
El suero de leche es el subproducto más abundante de la industria láctea, es el residual
obtenido de la manufactura del queso. Este subproducto es de difícil aceptación en el
mercado (Cira y col., 2002) aunque actualmente se está siendo utilizado por deportistas. La
fermentación láctica se ha propuesto como alternativa para el tratamiento de estos desechos,
ya que ofrece atractivas ventajas, tales como; bajos costos de inversión, lo cual es muy
importante en lugares donde no se cuenta con infraestructura, dar un uso integral a los
desechos, ya que se puede separar productos de alto valor comercial como quitina,
pigmentos y proteínas (Urribarri y col., 2004).
La fermentación láctica es un proceso celular anaeróbico donde se utiliza glucosa para
obtener energía y donde el producto de desecho es el ácido láctico. Este proceso lo realizan
muchas bacterias (llamadas bacterias lácticas), hongos, algunos protozoos y en los tejidos
animales. Un ejemplo de este tipo de fermentación es la acidificación de la leche. Ciertas
bacterias (Lactobacillus, Streptococcus) al desarrollarse en la leche utilizan la lactosa como
fuente de energía. La lactosa, al fermentar, produce energía que es aprovechada por las
Dra. Marinela Nazareth Colina Rincón y col.
4
bacterias, y el ácido láctico es eliminado. La coagulación de la leche (cuajada) resulta de la
precipitación de la caseína, proteínas de la leche y ocurre por el descenso de pH
(acidificación), debido a la presencia de ácido láctico (Urribarri y col., 2004). Los estudios por
fermentación láctica involucran el uso de bacterias del ácido láctico (Lactobacillus) para la
desproteinización y descalcificación del material, obteniéndose quitina como producto final.
(Urribarri y col., 2004; Parra 2009).
Las bacterias ácido lácticas son microorganismos que generan ácido láctico como único
producto de fermentación (Parra 2010). Tienen diversas aplicaciones, siendo una de las
principales la fermentación de alimentos como la leche, carne y vegetales, para obtener
productos como yogurt, queso, encurtidos, embutidos, ensilados, entre otros (González y col.,
2003; Duran y col., 1997). Las bacterias ácido lácticas se encuentran ampliamente
distribuidas en la naturaleza, para su adecuado crecimiento requieren de azúcares como
glucosa y lactosa, además de aminoácidos, vitaminas y otros factores de crecimiento, la
temperatura es uno de los factores más importantes que influyen en el crecimiento de las
mismas. Las bacterias lácticas están conformadas por un amplio grupo de bacterias no
esporuladas, Gram positivas que metabolizan un amplio rango de azúcares. Los mayores
productores de ácido láctico pertenecen a las familias Streptococcaceae (géneros
Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerobacter y Gemella) y
Lactobacillaceae (género Lactobacillus) (Ramírez y col., 2011; Estela y col., 2007; Serna, L;
Rodríguez, A, 2005; Vásquez y col., 2009).
El ácido láctico es el hidroxiácido más sencillo que existe, y un compuesto químico con gran
demanda a nivel mundial, el mismo, es ampliamente utilizado en las industrias alimentaria,
farmacéutica, médica y cosmética, como materia prima para síntesis orgánica, como
purgante en forma de lactato de calcio o lactato de magnesio, como removedor de sales de
calcio y en la producción de plásticos biodegradables (Araya y col., 2010; Gil, R. Dominguez,
A, 2007). El ácido láctico puede producirse por biotransformación o por síntesis química. La
síntesis química requiere de costosos y complicados procedimientos de obtención y
separación para lograr un producto final con la pureza deseada. Por otro lado, para la
producción de ácido láctico por biotransformación se requiere de sustratos carbonosos
complejos, tales como glucosa, lactosa, almidón y celulosa; la forma más rentable es por
medio de una glucolisis (Serna, L; Rodríguez, A, 2007; AOAC 1990; Escorcia y col., 2009).
2. METODOLOGIA
Extracción de Quitina Utilizando Ácido Láctico
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 5
2.1. Materiales
Se utilizaron los desechos de caparazones de crustáceos provenientes del Lago de
Maracaibo, Venezuela. Para la desproteinización de los mismos se utilizó NaOH (98%, Riedel
de Haën) y sulfito de sodio (Merck, G.A.) como agente antioxidante, luego fueron
desmineralizados con HCl al 36% (Riedel de Haën). Para la obtención de quitina utilizando
ácido láctico se realizó una fermentación láctica, usando suero de leche del Estado Zulia,
Venezuela, subproducto proveniente de la elaboración de queso, azúcar y melaza como
fuente de carbono. Para la fermentación se usó un fermentador de fabricación propia, usando
un envase de plástico de 2 L, al cual se le adaptó una manguera de plástico, por medio de la
cual se tomaba las muestras líquidas durante el proceso de fermentación. Para la
caracterización fisicoquímica se empleó un Espectrómetro FTIR marca Shimadzu modelo
FTIR 8300, estufa (Oven SO-030), una mufla (Thermolyne). Para evaluar los minerales se
usó un Espectrofotómetro de emisión de plasma acoplado a un espectrómetro de masas
(ICP-MS) (Agilent Technologies 7500). Para la desmineralización los desechos de
caparazones de crustáceos provenientes de la planta procesadora (Promarca) se
recolectaron 8 kg de desechos al azar.
2.2. Métodos
Obtención de quitina con HCl: Los desechos de cangrejos se molieron en el molino
industrial (Acerinox) a un tamaño promedio de 10 cm, para posteriormente desproteinizarlos,
colocando los desechos de crustáceos luego en un reactor de 10,3 mt
3
en el cual se trataron
con una solución de NaOH en una relación 1:1 (m/v) y sulfito de sodio como agente
antioxidante, para evitar la degradación del material. Luego se calentó a 100-110
o
C, para
disolver las proteínas. Se procedió a lavar repetidas veces con abundante agua destilada, se
secaron los desechos a temperatura ambiente por 24 horas. Los desproteinizados obtenidos
se trataron con una solución de HCl a temperatura ambiente, variando la concentración y
tiempos de reacción, los desechos desmineralizados se secaron al sol para decolorarlos y
así obtener la quitina. La quitina obtenida se lavó con abundante agua, hasta un pH cercano
a 7 (Beany y col., 2005).
2.2.1. Obtención de quitina con ácido láctico proveniente de fermentación láctica
El proceso de fermentación se llevó a cabo en un fermentador, donde se depositaron los
desechos triturados y el suero de leche enriquecido con azúcar al 5% m/v, 10% m/v y 15%
m/v en proporción 1:2; con melaza al 5% v/v, 10%v/v en la misma proporción, estas mismas
concentraciones se llevaron a cabo para evaluar la capacidad desmineralizante del ácido
láctico pero partiendo de conchas de cangrejo desproteinizadas. La fermentación por lote se
Dra. Marinela Nazareth Colina Rincón y col.
6
realizó por un periodo de 2 y 3 semanas a temperatura ambiente. Cada 24 horas la mezcla
fue agitada por lapsos de tiempos de 10 a 30 min. Seguidamente fueron tomadas alícuotas
de 50 mL del licor cada 24 horas. El licor recolectado del fermentador permitió evaluar la
remoción de minerales provenientes del caparazón de crustáceos durante la fermentación
láctica (Marcia y col., 2011). Al final del proceso la quitina obtenida se lavó con abundante
agua y se secó al sol por 24 horas para decolorarlas.
2.3. Análisis químico de las muestras
El análisis químico del licor recolectado del fermentador permitió evaluar el aumento de la
concentración de ácido láctico en el sistema y la remoción de minerales provenientes del
caparazón de crustáceos durante la fermentación láctica.
2.3.1. Determinación del porcentaje de acidez total titulable (% ATT)
Se colocaron 2 mL del licor-muestra, 50 mL de agua destilada y 5 gotas de fenolftaleína en
un matraz Erlenmeyer de 125 mL. La muestra se tituló con una solución estandarizada de
NaOH 0,1 M.
2.3.2. Determinación de Minerales
Se realizó en muestras sólidas, antes y después del proceso de obtención de quitina, y en
líquidas antes, durante y al final del proceso de fermentación por (ICP-MS). Las muestras se
trataron de la siguiente manera: Para las muestras sólidas se pesaron 0,1 g de muestra
sólidas en cápsulas de teflón, luego se les añadió 3 mL de ácido nítrico (HNO
3
) y 3 mL de
agua, se colocaron en bombas de digestión y se llevaron a estufa a una temperatura entre
105-110 ºC por 2 horas, al final se llevó a un volumen de 25 mL con agua desionizada. Para
las muestras líquidas se colocaron 3 mL de muestra en capsulas de teflón, adicionando 1 mL
de HNO
3
, colocándose en bombas de digestión y llevando a estufa a una temperatura de
entre 105-110 ºC por 2 horas, luego se enraso a 25 mL.
2.3.3. Caracterización fisicoquímica de las quitinas obtenidas
El contenido total de cenizas se determinó por el Método Oficial de Análisis Químico (AOAC)
(Escorcia y col., 2009). Espectroscopia de Infrarrojo con Transformada de Fourier (FTIR) Los
espectros de quitina se tomaron elaborando pastillas de bromuro de potasio (KBr) mezclando
2 mg de quitina con 148 mg de KBr seco. Las pastillas fueron medidas en un intervalo de
400-4000 cm
-1
.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Extracción de Quitina Utilizando Ácido Láctico
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 7
Para la desproteinización de los desechos de cangrejos, se trataron las conchas de cangrejo
con diluciones 0,5; 1,5; 2,5 M de NaOH a altas temperaturas (110-115 ºC) en diferentes
tiempos de reacción de 0,5; 1,0; 1,5 horas, alcanzando a desnaturalizar la proteína, esto es
debido a que el NaOH rompe los enlaces de hidrógenos que mantienen las moléculas de las
proteínas unidas, logrando que se separen y dispersen en la solución. La adición de Na
2
SO
3
como antioxidante evita las rupturas de la unión 1-4 glicosídica de las cadenas poliméricas
de la quitina, lo cual llevaría a la disminución del peso molecular de la misma. Como se puede
apreciar en la Tabla 1 para las distintas concentraciones de NaOH a medida que aumenta el
tiempo de reacción hay en promedio un aumento de 8,5% de la concentración de proteínas,
es decir que el aumento en la recuperación de proteínas con la concentración es solo 8,5%.
Esto industrialmente no es significativo y eleva los costos de NaOH y también energía. Para
una concentración de 0,5 M y un tiempo de reacción de 0,5 horas ya se ha recuperado el
92% de las proteínas siendo más aceptable y económico.
Tabla 1. Desproteinización del caparazón de cangrejo a distintas concentraciones de álcali y
tiempos de reacción.
Concentración de
NaOH (M)
Tiempo de reacción
(H)
Concentración de
proteínas
(µg/mL)
0,5
0,5
4,33±23
1,0
4,66±32
1,5
4,72±29
1,5
0,5
4,47±28
1,0
4,67±31
1,5
4,86±27
2,5
0,5
4,51±32
1,0
4,69±29
1,5
4,99±33
Desmineralización con HCl: En este procedimiento ocurre la remoción de sales de carbonato
de calcio (CaCO
3
) y fosfato de calcio (Ca
3
(PO
4
)
2
) y otros minerales presentes en los
caparazones. En la Tabla 2 se presentan los resultados obtenidos de la remoción de
minerales del caparazón de cangrejo en tiempos de reacción y concentración de HCl
distintos.
En la Tabla 2 puede observarse que a medida que el tiempo de reacción se incrementa la
concentración de minerales en solución, aumenta ligeramente en un 2% aproximadamente.
Esto no es significativo por lo que sería suficiente 1 hora para la desmineralización. Con
respecto a la concentración se puede apreciar que se incrementa la extracción de minerales
cuando se pasa de una concentración de 1 M a 2 M es decir que para una concentración de
HCl de 2 M y un tiempo de 2 horas es suficiente para una buena remoción.
Dra. Marinela Nazareth Colina Rincón y col.
8
Tabla 2. Remoción de minerales usando HCl a distintas concentraciones y tiempos de
reacción.
Concentración
HCl (M)
Tiempo
(H)
Ca
(mg/kg)
1
1
95,7
2
98,5
2
1
150,2
2
153,6
Extracción de quitina usando fermentación láctica: En el método biológico, la función de
desproteinizar y desmineralizar el material están a cargo de las bacterias (Lactobacillus) a
través de la fermentación ácido láctica, la cual causa una reducción gradual del pH y un
aumento de la acidez total titulable (Duran y col., 1997). Los azúcares como lactosa, glucosa
y aminoácidos presentes, sirven como fuente de energía para que las bacterias ácido lácticas
puedan producir ácido láctico, el cual actuará sobre los caparazones de cangrejos
(Parra 2010).
En los gráficos de la Figura 2 se presenta el comportamiento del pH (a) y % ATT (b), que
puede ser expresado como porcentaje de ácido láctico, en función del tiempo de fermentación
ácido láctica en un periodo de 2 semanas para las distintas muestras. Se puede observar
(Figura 2a) como a medida que transcurre el tiempo de fermentación fue decreciendo el pH
en la muestra de A 10%, de un pH inicial del suero de 4,60 a un pH final de 3,98.
(a) (b)
Figura 2. Variación del pH y el porcentaje de acidez total titulable durante la fermentación a
las 2 semanas (a) pH y (b) % ATT (A: Azúcar M: Melaza).
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
0 5 6 7 8 9 12 13 14
%ATT
Tiempo (dias)
Fermentación 2 semanas
A5%
A10%
M5%
M10%
Extracción de Quitina Utilizando Ácido Láctico
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 9
En la Figura 2b, se aprecia claramente como para la misma muestra el porcentaje de acidez
total titulable aumenta y el cual puede ser expresado como porcentaje de ácido láctico, este
comportamiento es el resultado de la producción metabólica de ácido láctico a partir de la
fuente de carbono (Araujo y col., 2009), indicando un adecuado crecimiento de las bacterias
lácticas presentes y una consecuente producción de ácido láctico a partir de la fuente de
carbono (Cira y col., 2002).
En el proceso metabólico primeramente ocurre una separación de la sacarosa en glucosa y
fructosa, y la lactosa en glucosa y galactosa. En la glucolisis, la glucosa se oxida para formar
el ácido pirúvico, seguidamente por fermentación láctica este es transformado en ácido láctico
(Figura 3) (Shirai y col., 2001).
Figura 3. Producción metabólica de ácido láctico por fermentación láctica (Shirai y col., 2001).
La concentración de la fuente de carbono juega un papel importante en el crecimiento
adecuado de las bacterias lácticas. Se ha encontrado en la literatura una concentración
óptima para el adecuado crecimiento de las bacterias de un 10% de sacarosa, lo cual
concuerda con los resultados mostrados en la Figura 2, donde también se observa que para
la misma fuente de carbono (azúcar) a una menor concentración no se apreció una
disminución del pH. Por tanto una concentración de 5% m/v de azúcar, no es suficiente fuente
de energía para el adecuado crecimiento de las bacterias generadoras del ácido láctico. Por
otro lado a una concentración mayor, es decir, 15 % m/v al transcurrir 3 días de fermentación
el sistema se coaguló por completo formando una masa dentro del fermentador, esto se debe
a la baja cantidad de agua en el sistema debido a la alta concentración de azúcar en el mismo,
causando una posible putrefacción debido a la competencia de los organismos de
descomposición con las bacterias lácticas por el azúcar metabolizable (Araujo y col., 2009).
Dra. Marinela Nazareth Colina Rincón y col.
10
Con respecto al uso de melaza como fuente de carbono para el crecimiento de las bacterias
se puede determinar claramente según los resultados mostrados en la Figura 2, que la
melaza no aporta a las bacterias la energía suficiente para su crecimiento debido a que en
ningún momento de la fermentación ocurre un descenso del pH por tanto no hay una buena
producción de ácido láctico, este comportamiento se puede atribuir a la concentración de
azúcares metabolizables en la melaza que es aproximadamente 65% (Shirai y col., 2001). Al
finalizar el tiempo de fermentación en el periodo de 2 semanas se observó que la muestra
de A 5% donde no ocurrió una adecuada reducción de pH, mostrando las conchas de
cangrejo algunas partes blandas y otras duras además de un olor desagradable, la condición
de pH bajo reduce el crecimiento de bacterias o microorganismos, como las Pseudomonas,
ya que promueven la putrefacción de los desechos de cangrejo (Shirai y col., 2001). Al no
presentar un pH bajo las condiciones se optimizan para una putrefacción de los caparazones
en el sistema. Para los caparazones donde se utilizó melaza como fuente de carbono, estos
tomaron el color marrón característico de la misma; al tacto las conchas estaban más duras
y el olor desagradable más acentuado en el líquido al finalizar la fermentación, incluso la
menor concentración de melaza no completo las 2 semanas de estudio. Sin embargo, para
la muestra donde se usó un 10% de azúcar m/v el licor al finalizar el proceso presento un
color rojizo, con un olor ligeramente ácido pero a la vez dulce generado por la condición de
bajo pH ayudando a conservar el licor. Las conchas de cangrejo estaban blandas con algunas
zonas endurecidas, indicando una buena remoción de minerales por parte del ácido láctico
producido. En los gráficos de la Figura 4 se presenta el comportamiento del pH 4 (a) y %
ATT 4 (b), que puede ser expresado como porcentaje de ácido láctico, en función del tiempo
de fermentación ácido láctica en un periodo de 3 semanas para la muestra de 10% de
concentración de azúcar.
(a) (b)
Figura 4. Variación del pH y el porcentaje de acidez total titulable durante la fermentación a
las 3 semanas (a) pH y (b) % ATT (A: Azúcar M: Melaza)
Extracción de Quitina Utilizando Ácido Láctico
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 11
En el periodo de fermentación de 3 semanas solo la muestra de azúcar al 10% m/v se pudo
mantener durante el tiempo del estudio en el cual se observa que al igual que para el tiempo
de 2 semanas la muestra presenta disminución del pH en la Figura 5 (a), de pH inicial de
4,66 a un pH final de 3,92 aumentando el % ATT de 1,86 a final de 3,19 en la Figura 5 (b);
con estos resultados se determina claramente que la concentración adecuada para el
crecimiento de las bacterias lácticas y obtener una buena producción de ácido láctico es de
10% m/v de azúcar.
En el periodo de fermentación de 3 semanas se pudo apreciar que el licor al finalizar el
proceso presentó un color rojizo indicando remoción de pigmentos asociados a la quitina en
el caparazón cangrejo, con un olor ligeramente ácido pero a la vez dulce, las conchas de
cangrejo estaban blandas en su totalidad, indicando una buena remoción de minerales por
parte del ácido láctico producido. Al finalizar los estudios de 2 y 3 semanas se observó que
las conchas presentaban restos de proteínas. Para remover dichas proteínas de la quitina
obtenida las conchas se lavaron con abundante agua y se secaron al sol por 24 horas. El
proceso de desproteinizacion en la fermentación es realizada por las enzimas peptidasas,
que están presentes de manera natural en el crustáceo. Dichas enzimas actúan rompiendo
los enlaces peptídicos de las proteínas (Marcia y col., 2009).
Fermentación usando conchas desproteinizadas (CD): Para evaluar la capacidad
desmineralizante del ácido láctico sobre los caparazones de cangrejos se colocaron en el
fermentador conchas previamente desproteinizadas con suero enriquecido con la misma
fuente de carbono y las concentraciones usadas anteriormente. En la Figura 5 se presentan
los gráficos de los resultados obtenidos de la fermentación durante un periodo de 3 semanas
de conchas desproteinizadas.
En los gráficos mostrados en la Figura 5 (a) se aprecia claramente que en ningunas de las
concentraciones usadas para las fuentes de carbono se evidencia un descenso de pH, solo
para la concentración de A 10 % m/v se observó que durante las primeras dos semanas se
mantuvo el pH casi estable, posteriormente en la tercera semana de fermentación el pH
aumentó. En la Figura 5 (b) se encontró que no hubo un aumento del porcentaje de acidez
total titulable que representa el porcentaje de ácido láctico en el sistema. Las bacterias ácido
lácticas para su adecuado crecimiento requieren de azúcares como glucosa y lactosa,
además de aminoácidos, vitaminas y otros factores de crecimiento. Al usar conchas
desproteinizadas se priva de aminoácidos a las bacterias. Debido a esto no se observa
aumento del ácido láctico en el proceso de fermentación, para la muestra de A 10 % m/v se
mantuvo constante el pH, indicando que no solamente es indispensable una concentración
Dra. Marinela Nazareth Colina Rincón y col.
12
adecuada de azúcar sino también la presencia de proteínas para promover eficazmente el
crecimiento de bacterias lácticas y así la producción de ácido láctico durante la fermentación.
(a) (b)
Figura 5. Variación del pH y el porcentaje de acidez total titulable durante la fermentación a
las 3 semanas para cáscara previamente desproteinizadas (a) pH y (b) % ATT (A: Azúcar M:
Melaza).
Al finalizar la fermentación en los periodos respectivos de 2 y 3 semanas se analizó la
cantidad de minerales presentes en las quitinas obtenidas y en el licor de fermentación.
En la Tabla 3 se presentan los resultados obtenidos para los minerales presentes en las
quitinas obtenidas al final de cada proceso, donde se puede ver la concentración de magnesio
(Mg), potasio (K) y calcio (Ca) encontrados en la concha sin ningún tipo de tratamiento,
mostrando una concentración de 44,45 mg/L del Mg; 23,23 mg/L de K y 896,42 mg/L de Ca.
Tabla 3 Concentración de minerales en las quitinas obtenidas.
Se puede observar, que la quitina obtenida mediante tratamiento químico presenta la menor
cantidad de minerales asociados, alcanzando un alto porcentaje de remoción, de 97,24%
para el Mg, 96,93% para K y un 98,92% de Ca. Por otro lado en el proceso biológico, en las
Muestra
Día
Mg (mg/L)
K (mg/L)
Ca (mg/L)
Caparazón de
cangrejo sin tratar
-
44,45
23,38
896,42
A 5%
14
6,24
7,07
265,78
A 10%
14
4,39
6,15
219,98
21
1,50
1,02
64,36
M 5%
12
10,91
10,40
413,20
M 10%
14
6,32
9,37
356,10
HCl
-
1,22
0,71
9,70
Extracción de Quitina Utilizando Ácido Láctico
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 13
quitinas obtenidas en la muestra A 10% la concentración de los minerales en los sólidos es
menor que para el resto de las muestras, corroborando así la concentración de 10% de
azúcar como óptima para la formación de ácido láctico. En la fermentación llevada a cabo en
3 semanas se alcanzó un 96,62% de remoción del Mg; un 95,62% de remoción de K y un
92,82% de Ca la fermentación en un tiempo de 2 semanas alcanzó porcentajes de remoción
de 90,10%; 73,67%; 75,46% respectivamente. Se pudo observar, que al extender el tiempo
de fermentación de 2 a 3 semanas la cantidad de mineral que queda en la concha es mucho
menor, indicando un mayor porcentaje de remoción de minerales. El ácido láctico formado
mediante la fermentación, reacciona con los minerales asociados a la quitina en el caparazón
de crustáceos, formando lactatos del mineral y logrando la desmineralización. En la Tabla 4
se presentan los resultados obtenidos de la remoción de minerales del caparazón de
crustáceos al licor producido.
Claramente los datos experimentales muestran que hubo un aumento en la concentración de
minerales en el suero (día 0) al licor a finalizar la fermentación. En la desmineralización, 2
moléculas de ácido láctico reaccionan con una molécula del mineral permitiendo formación
al lactato.
Tomando en cuenta que el calcio es el mineral más abundante asociado a la quitina en el
caparazón se tiene:
2 CH
3
CHOHCOOH(sln) + CaCO
3
(s) Ca(CH
3
CHOHCOOH)
2
(sln) + CO
2
(g) + H
2
O(l) Ec. 1
Tabla 4. Determinación de minerales en el líquido de fermentación.
Los lactatos producidos pueden ser recuperados del sistema, para su utilización en la
industria de alimentos. En la tabla anterior, se puede ver para las muestras donde se usó
melaza como fuente de carbono la concentración de magnesio y potasio en el licor al finalizar
es muy elevado, debido a la concentración de estos minerales en la melaza. El contenido de
Muestras
Día
Mg (mg/L)
K (mg/L)
Ca (mg/L)
Suero
0
2,33
4,00
61,35
A 5%
14
28,56
16,92
484,52
A10%
14
32,63
26,12
679,32
21
38,56
40,23
768,02
M 5%
7
38,29
143,54
478,74
M 10%
14
38,78
160,73
438,84
Dra. Marinela Nazareth Colina Rincón y col.
14
cenizas es un indicador de la efectividad del proceso de desmineralización debido a la
eliminación de los minerales presentes, constituidos principalmente por carbonato de calcio
(CaCO
3
) y fosfato de calcio en menor proporción.
En la Tabla 5 se aprecia con el ácido clorhídrico a 2 M y un tiempo de reacción de 50 minutos
se presentó un contenido de cenizas de 1,99%, el cual está dentro del intervalo aceptado
para este producto (≤ 2%) grado alimenticio especificado por varias casas fabricantes.
Tabla 5. Porcentaje de cenizas de las quitinas obtenidas desmineralizadas con HCl
Concentración (M)
Tiempo (min)
Ceniza (%)
1
30
4,48
40
4,46
50
4,00
2
30
2,48
40
2,09
50
1,99
3
30
1,98
40
1,97
50
1,97
Este tratamiento se considera el más efectivo para la remoción de minerales, ya que la
desmineralización se debe evitar altas concentraciones de ácido por la posibilidad de la
degradación de la quitina.
En la Tabla 6, se evidencia claramente que para la concentración de A 10% se obtuvo muy
buena desmineralización debido a que la quitina obtenida presentó un bajo contenido de
ceniza 2,68 %, un valor bastante cercano al aceptado. De acuerdo a los valores mostrados
la eficiencia de la remoción de calcio en el proceso biológico depende grandemente de la
cantidad de fuente de carbono añadido.
Tabla 6. Variación de las cenizas de las quitinas obtenidas partiendo de concha cruda (CC)
y concha desproteinizada (CD).
Muestra
Ceniza CC (%)
Ceniza CD (%)
A 5%
14,65
64,68
A10%
2,68
49,03
M 5%
41,16
69,40
M 10%
18,89
50,42
Extracción de Quitina Utilizando Ácido Láctico
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 15
Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR): En la Figura 6a se
muestra el espectro de infrarrojo de la quitina obtenida con ácido láctico en un periodo de
fermentación de 3 semanas, revelando la presencia de grupos hidroxilo (-OH) que pertenecen
a una vibración a 3600-3500 cm
-1
, la banda a los 3296 cm
-1
corresponde a la tensión del
grupo N-H, mientras que la banda a los 2931 cm
-1
corresponde a una vibración tensión del
grupo C-H, se aprecian las bandas de la amida I y II cerca de los 1650 y 1550 cm
-1
correspondientes a la quitina.
En la Figura 6b se aprecia el espectro de infrarrojo de la quitina extraída con previa
desmineralización con ácido clorhídrico. Se puede ver la señal de vibración –OH a 3475 cm
-
1
, la banda a los 3267cm
-1
corresponde a la tensión del grupo N-H, mientras que la banda a
los 2926cm
-1
cm corresponde a una vibración tensión del grupo C-H, se aprecian las bandas
de la amida I y II cerca de los 1650 y 1550 cm
-1
correspondientes a la quitina.
6(a)
6(b)
Figura 6 (a y b): 6a. Espectro FTIR de quitina obtenida con ácido láctico. 6b Espectro FTIR
de quitina obtenida con ácido clorhídrico.
Dra. Marinela Nazareth Colina Rincón y col.
16
4. CONCLUSIONES
El azúcar resultó ser efectiva como fuente de carbono en vez de la melaza para el adecuado
crecimiento de las bacterias acido lácticas y la producción de ácido láctico, evidenciando un
descenso del pH y un aumento del %ATT.
La fermentación láctica depende grandemente de la fuente de carbono y de la concentración
de la misma para obtener quitina. Al incrementar el tiempo de fermentación de 2 a 3 semanas
se incrementa la remoción de minerales en la concha dando un 2,68% de porcentaje de
ceniza en la quitina obtenida. La obtención de quitina empleando fermentación láctica usando
CD no presentó buenos resultados, ya que no evidencian descenso de pH ni aumento del
%ATT.
La concentración óptima para la adecuada producción de ácido láctico vía fermentativa es el
enriquecimiento del suero lácteo con azúcar 10 % m/v permitiendo la recuperación de
productos de valor agregado.
Teniendo en cuenta los resultados mostrados anteriormente, la ventaja principal que tiene el
tratamiento químico es el tiempo de reacción para obtener quitina, que es más corto en
comparación con el método biológico o fermentación. Sin embargo, la extracción de quitina
por fermentación láctica muestra como ventaja un mayor manejo de desechos (suero lácteo
y conchas de cangrejo), aunque el tiempo de extracción del producto final es más largo que
con tratamiento químico, presenta bajos costos, además de ser amigable al medio ambiente
y en el cual no solamente se puede obtener quitina, sino lactato de calcio que puede ser
recuperado y posteriormente usado en la industria de alimentos para la fortificación de
bebidas.
Debido a que los problemas ambientales han ido aumentando con el desarrollo de la
tecnología, esta investigación arrojó resultados que contribuyen al manejo de desechos para
la elaboración de productos de alto valor agregado resultando ser más económico y amigable
al medio ambiente.
5. REFERENCIAS
AOAC (Association of Official Analytical Chemists) 1990. Official Methods of Analysis, Methods
923.03 Cenizas, 16th Edition, USA, 4:40-42.
Araujo, A; Costa, L; Muniz, E; Nascimento, A; Lourenço, L; Bergamasco, R. (2009). “Fermentacion
de residuos de cangrejo y camaron para la obtención de quitinases en medio sólido”. Nucleo
de Engenharia de Alimento Campus Univertitario de São Cristóvão, São Cristóvão- Brazil. 1-4.
Extracción de Quitina Utilizando Ácido Láctico
Instituto de Ciencias Básicas. Universidad Técnica de Manabí. Portoviejo-Ecuador 17
Araya, C; Rojas, C; Velásquez, C. (2010). “Síntesis de ácido láctico, a través de la hidrolisis
enzimática simultánea a la fermentación de un medio a base de un desecho de piña (Ananas
Comosus), para sus uso como materia prima en la elaboración de ácido poliláctico”. Revista
Iberoamericana de Polímeros 11 (7): 407-416.
Ayala, A.; Colina, M.; Molina, J.; Vargas, J.; Rincón, D.; Medina, J.; Rosales, L.; Cárdenas, H. (2014).
“Evaluación de la actividad antifúngica del quitosano contra el hongo Mycosphaerella Fijiensis
Morelet que produce la Sigatoca negra que ataca el plátano”. Revista Iberoamericana de
polímeros 15 (6): 312-338.
Beany, P.; Lizardi, J.; Healy, M. (2005). ”Comparison of chitins produced by chemical and
bioprocessing methods”. Journal of Chemical Techology and Biotechnology 80 (2): 145-150.
Belandria, J.; Morillo, N. (2008). “Recuperación de quitina a partir de los residuos sólidos generados
del procesamiento industrial de crustáceos”. Revista Cubana de Química XX (3): 17-26.
Carrilo, J. (2006). “Tratamiento y reutilización del suero de leche”.
http://www.lactodata.com/lactodata/docs/lib/jose_luis_carrillo_tratamiento_reutilizacion_2002.p
df, consultada el 2-2-2015.
Cira, L.; Huerta, S.; Shirai; K. (2002). “Fermentación láctica de cabezas de camarón (Penaus sp) en
un reactor de fermentación sólida”. Revista Mexicana de Ingeniería Química 1: 45-48.
Colina, M.; Ayala, A.; Rincón, D.; Molina, J.; Medina, J.; Ynciarte, R.; Vargas, J.; Montilla, B. (2014).
“Evaluación de los procesos para la obtención química de quitina y quitosano a partir de
desechos de cangrejos. Escala piloto e Industrial”. Revista Iberoamericana de Polímeros 15 (1):
21-43.
Crini, G. (2005). “Recent developments in polysaccharide-based materials used as adsorbents in
wastewater treatment”. Progress in Polymer Science 30(1): 38-70.
Duarte, M.; Ferreira, M.; Marvao, M.; Rocha, J. (2002). “An optimised method to determine the
degree of acetylation of chitin and chitosan by FTIR Spectroscopy”. International Journal of
Biological Macromolecules 31: 1-8.
Duran, C.; Romero, C.; García, P.; Brenes, M. (1997). “Bacterias del ácido láctico en la fermentación
de aceitunas de mesa”. Grasas y aceites 48 (5): 297-311.
Escorcia, D.; Hernández, D.; Sánchez, M.; Benavente, M. (2009). “Diseño y montaje de una planta
piloto para la extracción de quitina y proteínas”. Revista científica Nexo 22 (2): 45-55.
Estela, W.; Rychtera, M.; Melzoch, K.; Quillama, E.; Egoavil, E. (2007). “Producción de ácido láctico
por Lactobacillus Plantarum L10 en cultivos batch y continuo”. Revista Peruana de Biología 14
(2): 271-275.
Gil, R.; Dominguez, A. (2007). “Bioproduccion de ácido láctico a partir de residuos de cascara de
naranja: proceso de separación y purificación”. Revista Tecnología, Ciencia y Educación 23 (2):
79-90.
González, B.; Gómez, M.; Jiménez, Z. (2003). “Bacterias de prebióticos”. Revista Salud Publica y
Nutrición Vol. 4.
Hernandez, H.; Águia, E.; Flores, O.; Viveros, E.; Ramos, E. (2009). “Obtención y caracterización
de quitosano a partir de exoesqueletos de camarón”. Superficies y Vacío 22 (3): 57-60.
Jakymec, M.; Moran, H.; Páez, G.; Ferrer, J.; Mármol, Z.; Ramones, E. (2001). “Cinética de la
producción de ácido láctico por la fermentación sumergida con lactosuero como sustrato”.
Revista Científica FCV-LUZ XI (1): 53-59.
Dra. Marinela Nazareth Colina Rincón y col.
18
Juárez, C. (2010). “Estudio de uso de enzimas comerciales en la preparación de quitina a partir de
desperdicios de camarón”. Trabajo de Grado, Especialización en Biotecnología, Universidad
Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, pp 1-10.
Larez, C. (2003). “Algunos usos del quitosano en sistemas acuosos”. Revista Iberoamericana de
Polímeros 4 (2): 91-109.
Larez, C. (2006). “Quitina y quitosano: materiales del pasado presente y el futuro”. Avances en
Química 1 (2): 15-21.
López, C. (2009). “Extracción de quitina del exoesqueleto del camarón blanco, para la obtención de
quitosano utilizada como preservante de alimentos”, Manta- Ecuador. pp 12-13.
Marcia, E.; Malespín, J.; Sánchez, M.; Benavente, M. (2011). “Estudio de la fermentación láctica
para la obtención de quitina a partir de desechos de crustáceos”, Managua Nicaragua. pp 34,35.
Mármol, Z.; Cardozo, J.; Carrasquero, S.; Páez, G.; Chandler, C.; Araujo, K.; Rincón, M. (2009).
“Evaluación de polifenoles totales en vino blanco tratado con quitina”. Revista Facultad de
Agronomía (LUZ) 26: 423-442.
Parada, L.; Crespín, G.; Miranda; R.; Katime, I. (2004). “Caracterización de quitosano por
viscosimetría capilar y valoración potencio métrica”. Revista iberoamericana de Polímeros 5: 1.
Parra, R. (2009). “Lactosuero: importancia en la industria de alimentos”. Revista facultad nacional
de agronomía Medellín 62 (1): 4967-4982.
Parra, R. (2010). “Bacterias acido lácticas: papel funcional en los alimentos”. Facultad de Ciencias
agropecuarias 8 (1): 93-105.
Percot, A.; Viton, C.; Domard, A. (2003). “Optimization of chitin extraction from shrimp shells”.
Biomacromolecules 4 (1): 12-18.
Perentena, L.; González, C.; Celis, B.; Valbuena, A.; Colina, M. (2015). “Síntesis de bases de
SCHIFF derivadas del quitosano por reacción con p-dimetilaminobenzaldihido y 4-hidroxi-3-
metoxibenzaldehido”. Revista Iberoamericana de Polímeros 16 (1): 1-27.
Ramírez, J.; Rosas, P.; Velásquez, M.; Ulloa, J.; Arce, F. (2011). “Bacterias lácticas importancia en
los alimentos y sus efectos en la salud”. Revista Fuente 2: 7.
Rinaudo, M. (2006). “Chitin and chitosan: Properties and applications”. Progree in Polymer Science
31: 603-632.
Serna, L.; Rodríguez, A. (2005). ”Producción biotecnológica de ácido láctico: Estado del arte”.
Ciencia y Tecnología Alimentaria 5 (1): 54-65.
Serna, L.; Rodríguez, A. (2007). “Producción económica de ácido láctico utilizando residuos de
cosecha y jugo de caña de azúcar”. Revista Agricultura Técnica 67 (1): 29-38.
Shirai, K.; Guerrero, I.; Huerta, S.; Saucedo, G.; Castillo, A.; Gonzalez, R.; Hall, G. (2001). ”Effect of
initial glucose concentration and inoculation level of lactic acid bacteria in shrimp waste
ensilation”. Enzyme and Microbial Technology 28: 446–452.
Urribarri, L.; Vielma, A.; Páez, G.; Ferrer, J.; Mármol, Z.; Ramones, E. (2004). “Producción de ácido
láctico a partir de suero de leche utilizando Lactobacillus helveticus en cultivo continuo”. Revista
científica FCV-LUZ XIV (4): 297-302.
Vásquez, S.; Suarez, H.; Zapata, S. (2009). “Utilización de sustancias antimicrobianas producidas
por bacterias acido lácticas en la conservación de la carne”. Revista Chilena de Nutrición 36
(1): 64-71.