MSc. Laura Soto y col.
22
en bolsas herméticas a temperatura ambiente y en un lugar seco hasta su posterior uso
(Arveláez et al., 2003).
2.2.
Análisis proximal del orujo fresco
Se evaluaron las variables: humedad (método AOAC, 7.007), grasa cruda (método AOAC,
7.055), fibra cruda (método AOAC, 7.061), cenizas (método AOAC, 7.009) y proteínas
(método Kjeldahl AOAC, 7.015); en el orujo fresco. Cada variable evaluada se realizó por
quintuplicado
2.3.
Obtención de los extractos
La extracción de los compuestos fenólicos derivados de la uva se realizó por medio de
ultrasonido empleando como solvente etanol a diferentes concentraciones (100, 70 y 50%) a
un tiempo de 40 min. La temperatura osciló entre 30, 40, 50 y 60°C. Se pesaron 0,5 g de
muestra, se le agregaron 5 mL de solvente y se agitó (Vortex) por 2 minutos a una velocidad
intermedia. Los experimentos se realizaron por quintuplicado en un equipo de ultrasonido
(Elma, Potencia 35KHz). Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 10000 rpm (11200
fuerza g) por 5 min y se evaporaron a 50 °C hasta sequedad. Una vez evaporado totalmente
el solvente, se taparon. El extracto puro obtenido se mantuvo a - 4°C, en envases ámbar por
un máximo de 48 h (Guntero et al., 2014).
2.4.
Determinación del contenido de fenoles totales
Para la determinación del contenido de fenoles totales se utilizó el método indicado por
Amerine & Ought (1976) con algunas modificaciones. Se pesaron de 10 a 15 mg de los
extractos secos y se disolvieron cada uno en 1 mL de etanol, sin realizar diluciones. La
determinación se realizó empleando como solución patrón 1000 mg.L
-1
de ácido gálico (99%,
Riedel de Häen) a partir de la cual se realizó la curva de calibrado en el intervalo de 100-1000
mg ácido gálico.L
-1
. La preparación de las soluciones patrón se realizó agregando 1580 μL
de agua en tubos de ensayo, 20 μL de solución patrón o muestra y posteriormente se adicionó
100 μL de reactivo Folin. Se mezclaron uniformemente y se esperó 1 minuto antes de
adicionar a cada uno 300 μL de una solución al 20 % de carbonato de sodio Na
2
CO
3
(J.T
Baker); luego de esto, se dejaron reposar en la oscuridad, a 24 ºC por dos horas para
finalmente medir la absorbancia a 750 nm en un espectrómetro UV-visible con arreglo de
diodo (Thermo Scientific, Genesys 10S Uv-visible). Los resultados se expresaron en mg.L
-1
de equivalentes de ácido gálico (GAE, por sus siglas en inglés: Galic Acid Equivalents).
2.5.
Diseño del experimento