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Abstract— the present work reports the presence of bacteria
and fungi in particulate matter suspended in the exterior of three
hospitals in Guayaquil, during the month of March 2019, winter
time. The isolated microbial diversity was tolerant to a toxic
copper concentration of 3.1 mM. From the particulate material, a
greater number of bacterial than fungal species was isolated.
However, the fungal species found are related to nosocomial
diseases. This is a seed study that aims to lay the foundations for
the characterization of microbial diversity through bioprospecting
studies, based on aerodynamic factors (wind speed), climatic
factors (temperature and relative humidity) and physical
composition (content of dust in the air) to correlate the viability of
formation of bioaerosols in particulate material in Guayaquil
hospitals. Therefore, one of the objectives of the present work is
the investigation of the influence of the heavy metal copper in the
formulations of culture media to evaluate the microbial tolerance.
And due to the potential risk of lack of air control in health
institutions, the main objective of the present work is to evaluate
the growth conditions of microorganisms present in the suspended
particulate material surrounding three hospitals in Guayaquil.
Index Terms—nosocomial, pathogens, airborne, SEM
I. INTRODUCTION
N el año 2007, aproximadamente 1265 casos de infecciones
en periodos post-operatorios fueron reportados en 75 países
(Alghamdi et al., 2014; Chikere, Omoni, & Chikere, 2008;
Gilbert, Veillette, & Duchaine, 2010). Según la Organización
Mundial de la Salud (OMS), en 55 hospitales de 14 países un
8,7% de los pacientes hospitalizados presentaban infecciones
nosocomiales (Hambraeus, 1988; Lai, Emberlin, & Colbeck,
2009). Estas enfermedades son atribuidas a la carente gestión
de calidad del aire, debido al movimiento browniano del
material particulado que es medio de transporte de esporas
microbianas (Khan, Karuppayil, Manoharachary, Kunwar, &
Waghray, 2009). El denominado bioaerosol es material
particulado suspendido en el aire portador de bacterias, hongos,
virus y toxinas; y es responsable de contagio de enfermedades
(Atkinson, Mills, Walton, & Anderson, 2015; Goldwater,
Manoharan, & Jacobs, 1961; Jaffal, 1997; León, 2016).
Debido a su facilidad de transporte, las bacterias permanecen
en el espacio aéreo durante días o semanas, el tiempo suficiente
para completar ciclos reproductivos. Los bioaerosoles persisten
la bruma y neblina (Marchisio, Caramiello, & Mariuzza, 1989).
Generalmente, proteobacterias y firmicutes son filos
dominantes en el aire (Tormo Molina, Gonzalo Garijo, Muñoz
Rodríguez, & Silva Palacios, 2002); aunque en Nueva York,
existe una mayor abundancia relativa de actinobacterias (Li
et al., 2019). Los bioaerosoles dependen de las condiciones
atmosféricas dominantes; por ejemplo, las bacterias son
eliminadas de la atmósfera ya sea por deposición seca o húmeda
por la adherencia a edificios, plantas, agua, superficies, el suelo
y otras superficies en contacto con el aire (Smets, 2016).
En Ecuador, es inexistente una estadística actualizada sobre
casos de muerte debido a contaminación hospitalaria. Se ha
reportado que microorganismos como Serratia marcescens,
Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus coagulosa,
Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae son responsables de
algunos casos de afectación a pacientes. A pesar de las trágicas
consecuencias, nuestro país carece de estudios en Aerobiología
que verifiquen las tragedias reportadas. Y es la falta de datos
sobre diversidad microbiana, y el impacto del parque automotor
en la calidad del aire circundante a hospitales, lo que impide
tomar medidas efectivas para la inversión económica en
procesos de esterilización y desinfección hospitalaria.
La actividad celular de bioaerosoles depende de condiciones
ambientales y actividades humanas (Womiloju, Miller, Mayer,
& Brook, 2003). Esta actividad es función del grado de
contaminación del aire debido a compuestos orgánicos volátiles
(COVs), gases de combustión como CO, NO
2
y SO
2
, y además
a metales pesados (Haas et al., 2013). Por tanto, uno de los
objetivos del presente trabajo es la investigación de la
influencia del metal pesado cobre en las formulaciones de
medios de cultivo para evaluar la tolerancia relativa de
microorganismos aéreos a este metal pesado. Y debido al
potencial riesgo de la falta de control del aire en centros de
salud, el objetivo principal del presente trabajo se enfoca en
evaluar condiciones de crecimiento de microorganismos
presentes en el material particulado suspendido circundante a
tres hospitales de Guayaquil.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Se tomaron muestras de polvo ambiental en exteriores de tres
hospitales de Guayaquil, Ecuador en época invernal. Por
motivos de confidencialidad, no se incluyen detalles sobre la
posición geográfica de los hospitales. El material particulado
Carlos Banchón
1
, Tamara Borodulina
1
, Linda Diaz
2
, Amano Yasuji
2
1
Ingeniería Ambiental, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Agraria del Ecuador, 59304, Av.
25 de Julio y Pio Jaramillo, Guayaquil-Ecuador
2
Plataforma de Microscopía Electrónica y Confocal - Instituto Nacional de Investigación en Salud
Pública (INSPI) – Dr. Leopoldo Izquieta Pérez – Guayaquil-Ecuador
Aerobiología en hospitales de Guayaquil:
microorganismos resistentes a cobre
E
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2
fue tomado en cuatro puntos ubicados en las aceras de dos calles
principales (avenidas en las que circula transporte público) y
dos calles secundarias (con bajo flujo vehicular).
Se tomaron muestras de material particulado suspendido
mediante dispositivo (casero) portátil de succión con un caudal
de recolección de aire de aprox. 288 L durante 8 horas de
monitoreo (Marchisio et al., 1989). El material particulado
(tamaño de partícula de aprox. 10 µm) fue recogido en
portaobjetos de dimensiones 2 x 2 cm (Goldwater et al., 1961).
Posteriormente, la muestra fue cuidadosamente depositada en
cajas Petri con los respectivos medios de cultivo.
Se formularon medios de cultivo con una concentración de
cobre de 200 mg/L (3,1 mM). Además, para la bioprospección
de microorganismos, de las mismas muestras de material
particulado de periferias de los tres hospitales centinelas, se
utilizaron placas Petrifilm® (3M, USA) para coliformes totales
con indicador violeta rojo bilis. Se utilizó agar nutritivo para
aislamiento de bacterias (200 mg/L sulfato de cobre, 5 g/L
peptona, 1 g/L extracto de levadura, 5 g/L cloruro sódico, 15
g/L agar, a pH 7); y agar sabouraud para aislamiento de hongos
(200 mg/L sulfato de cobre, agar, 15 g/L, peptona de caseína 5
g/L, cloranfenicol 0,05 g/L, dextrosa 40 g/L, digerido péptico
de tejido animal 5 g/L).
Previa observación en microscopio electrónico de barrido
(SEM) JEOL-JSM 5310, las muestras fueron fijadas con
tetraóxido de osmio (OsO
4
) durante 24 horas. Luego, se realizó
una deshidratación mediante congelación con t-butanol 100%,
a 25°C, durante 6 horas, aplicable para el congelado seco del
espécimen. Se continuó con el montaje y pegamento de la
muestra con cinta de carbón doble adhesiva, y posterior
recubrimiento de la muestra con oro durante 20 segundos, lo
que aumentó la emisión secundaria de electrones en la
observación microscópica. Durante la observación en SEM, se
tomaron fotografías con un tiempo de exposición de 100
segundos por cada foto.
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se presentan los resultados de cuántas especies (en función
de las diferentes morfologías de sus colonias) crecieron bajo las
condiciones climáticas invernales del presente monitoreo.
Según la Fig. 1, en el agar nutritivo crecieron bacterias en
presencia de 200 mg/L de cobre (3,1 mM), lo cual nos permitió
determinar que el medio de cultivo, a pesar de la condición
tóxica, sí es medio de crecimiento de bacterias del material
particulado suspendido. En ninguna de las muestras se encontró
presencia de coliformes totales.
El cobre se requiere en pequeñas cantidades para el
crecimiento y funcionamiento de los microorganismos ya que
es un cofactor para actividades enzimáticas (Trevors & Cotter,
1990). No obstante, concentración elevada de cobre es factor
para la inhibición del crecimiento microbiano. En el presente
estudio, se demuestra que una concentración de 3,1 mM de
cobre (II) fue insuficiente para la inhibición del crecimiento de
hongos y bacterias. Por ejemplo, una concentración de
0,006 mg de Cu
+2
es tóxica para Aerobacter aerogenes (Smets,
2016).
La vida del bioaerosol se caracteriza por la escasez de
nutrientes y sustratos, afectación por radiación UV, desecación,
altas temperaturas y cambios de pH, así como la presencia de
especies reactivas de oxígeno (León, 2016; Saadoun, Tayyar, &
Elnasser, 2008). Los mecanismos de sobrevivencia microbiana
se atribuyen a la reparación del ADN y defensa por
pigmentación; estos mecanismos favorecen la adaptación
metabólica para sobrevivir la deficiencia de hierro (Raisi,
Aleksandropoulou, Lazaridis, & Katsivela, 2013; Smets, 2016).
Otro mecanismo de protección bacteriana es el estado de
latencia, donde las esporas se transforman morfológicamente o
sufren modificaciones de su pared celular; y así ralentizar o
detener su actividad metabólica (Gandolfi, Franzetti, Bertolini,
Gaspari, & Bestetti, 2011; Hall et al., 2001; Hambraeus, 1988;
Harding, 2017). Así, estas transformaciones pueden mejorar la
resistencia a las tensiones físicas como la radiación UV
Fig. 1. Colonias de bacterias aisladas del polvo atmosférico de exteriores de
hospitales de Guayaquil.
Las condiciones de humedad invernal se reportan en la Fig. 2
en función de los puntos de monitoreo de los tres hospitales y
en función del conteo de diferentes especies de bacterias
encontradas, según la morfología de la colonia y estructura
microscópica. Se destaca el comportamiento de crecimiento de
microorganismos en las vías principales con mayor tráfico
vehicular. Cabe mencionar también que, no solamente es el
tráfico vehicular uno de los factores que aumentan las
poblaciones microbianas en el aire; también aportan el alto
número de personas que se encuentran en los exteriores de los
hospitales. La respiración y el derramamiento de millones de
células de la piel contribuyen diariamente a los bioaerosoles en
el entorno construido (Ulirsch et al., 2007; Weber, 2003;
Womiloju et al., 2003; Xu & Yao, 2013). De hecho, la
ocupación humana podría ser el factor más importante que
afecte al número total y estructura comunitaria de los
bioaerosoles en el entorno, especialmente en ambientes mal
ventilados o muy ocupados (Prussin & Marr, 2015).
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Fig. 2. Promedio de conteo de diferentes especies de bacterias en cuatro puntos
de monitoreo en los exteriores de tres hospitales, en función de la humedad
relativa de marzo 2019.
La Fig. 3 reporta las condiciones del viento (dirección y
velocidad) en Guayaquil durante marzo de 2019, mes del
respectivo monitoreo. Además, se reporta el promedio de
hongos y bacterias encontrados en los tres hospitales. Se
observa que los puntos 1 y 3 fueron avenidas principales, con
flujo vehicular de transporte público (denominado Metrovía).
Sin embargo, el conteo de hongos y bacterias no fue
necesariamente alto, en referencia al punto 4 (calle secundaria);
en donde se encuentran las puertas principales de los hospitales.
En el presente estudio, el conteo más alto de hongos viables
fue de 24 unidades formadoras de colonias (UFC) m
-3
en
muestras de material particulado durante 8 horas de monitoreo.
Según reportes, se ha encontrado hasta una concentración
promedio de hongos viables en el aire de 80 UFC m
-3
en
muestras recolectadas de escuelas, hospitales, residencias, y
naves industriales; sin embargo, en algunos casos las
concentraciones fueron tan altas como 104 UFC m
-3
(Prussin &
Marr, 2015). Especialmente en hospitales, la resuspensión de
microorganismos del piso, vestimenta y muebles actúa como
fuente secundaria. Estudios han demostrado que el aire exterior
afecta al microbioma del aire interior (Chikere et al., 2008;
Gao, 2016; Prussin & Marr, 2015; Spiegelman, 1968).
Sobre la diversidad fúngica, se encontró en el hospital 1 la
presencia de Aspergillus spp., Fusarium spp, Cladosporium
spp.; en el hospital 2: Aspergillus spp., Trichoderma spp.,
Cladosporium spp.; y en el hospital 3: Aspergillus spp.,
Aureobasidium spp., Cladosporium spp. respectivamente. En el
siguiente diagrama de Venn (Fig. 4), se exponen las semejanzas
y diferencias del número de especies de hongos encontradas en
común en los tres hospitales. Esto a manera de comparar los
conjuntos de datos, y así encontrar correlaciones para predecir
las probabilidades de ocurrencia de presencia de hongos en el
aire. En el presente caso, Aspergillus spp. fue el denominador
común presente en el material particulado de los tres hospitales.
Se identificó la presencia de hongos con tolerancia al cobre
(metal pesado de efecto tóxico a elevadas concentraciones por
encima de 0.005 mM), en meses de invierno, con una humedad
relativa promedio entre 65 y 85%, sin ninguna preferencia por
la dirección del viento dominante (Nornoreste).
Fig. 4. Diagrama de Venn sobre semejanzas y diferencias del conteo de
diferentes especies de hongos en tres hospitales.
En promedio, se determinó que el número de especies
bacterianas fue mayor que el número de especies de hongos
(Fig. 5). Según los resultados aquí expuestos, se argumenta que,
el aumento de partículas en el aire producto de la velocidad y
dirección del viento promueve el aumento de diferentes
concentraciones de microorganismos en función de la época del
año, condición meteorológica y ambiental. Es de vital
importancia, promover estudios para evaluar la diversidad
microbiana patógena en relación con el materia particulado
(Haas et al., 2013).
Fig. 5. Frecuencia de diferentes especies microbianas (bacterias y hongos)
encontradas en tres hospitales de Guayaquil.
En Hospital 1, mediante microscopía se identificó al hongo
Fusarium spp. (Fig. 6). Por ejemplo, es conocido que Fusarium
chlamydosporum se ha descrito como un agente etiológico en
la fungemia asociada a catéter en un paciente con linfoma
linfocítico y como agente etiológico en una infección invasiva
en un paciente con anemia aplásica. Las hifas son septadas e
hialinas (Hambraeus, 1988). Sus conidióforos son monofialidos
76
78
80
82
84
86
88
90
0 5 10 15
P1
P2
P3
P4
Humedad relativa máx., %
Número de especies microbianas en polvo
Puntos de monitoreo
Hosp.1 Hosp.2 Hosp.3 Humedad
Fig. 3. Dirección y velocidad del viento en función del número de especies
microbianas encontradas (hongos y bacterias), según puntos de monitoreo.
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y polifialidos simples o ramificados (fialidos con más de una
abertura no delimitada por un tabique) (Hay, Clayton, &
Goodley, 1995). Características de Fusarium es que los
microconidios son abundantes, en forma de huso, septados, que
miden 6-26 x 2-4 µm y los macroconidios son raros, 3-5
septados, en forma de hoz, 30-38 x 3-4.5 µm miden (Hurst &
Crawford, 2007).
Fig. 6. Imagen SEM de hongo Fusarium spp.. aislado de material particulado
suspendido en hospital 1.
Las colonias de hongos de la muestra P1, hospital 2,
mostraron un crecimiento cubierto de masas viscosas de
conidios, crema o rosa, que luego se transformaron a negras
(Khan et al., 2009). Las hifas son hialinas y septadas, y forman
cadenas de artroconidia de una a dos células, de paredes gruesas
y pigmentadas de forma oscura (Hurst & Crawford, 2007).
Aureobasidium pullulans es un oligótrofo que se encuentra en
ambientes con fluctuaciones de actividades de agua, como
ocurre en la filósfera (Zalar et al., 2008).
Por ejemplo, Aureobasidium pullulans tiene una distribución
mundial y se suele aislar como un saprófito, ocasionalmente de
la piel y las uñas; también se ha descrito como un agente causal
poco frecuente de phaeohyphomycosis, queratitis micótica y
peritonitis en pacientes en diálisis peritoneal ambulatoria
continua (Zalar et al., 2008).
Fig. 7. Imagen SEM de especie de Aureobasidium en muestra P1, hospital 2.
En muestras del punto P1, del hospital 3, se aisló Aspergillus
spp. con las características de hifas septadas e hialinas (Viegas
et al., 2011), mientras que los conidióforos formados del pie
basal ubicada en las hifas de soporte y que terminan en una
vesícula en el ápice (Latgé, 1999). El Aspergillus es un hongo
filamentoso y común de encontrar en la atmósfera.
Por lo general, el Aspergillus se aísla del suelo, residuos
vegetales y del aire. Si bien se ha descrito un estado
teleomórfico solo para algunas de las especies de este hongo, se
acepta que otros son mitospóricos, sin ninguna producción de
esporas sexuales conocida (Hurst & Crawford, 2007).
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Fig. 8. Imagen SEM de especie de Aspergillus spp. en muestra P4, hospital 3.
IV. CONCLUSIONES
El presente trabajo reporta la presencia de bacterias y hongos
en material particulado suspendido en exteriores de tres
hospitales de Guayaquil, durante el mes de marzo de 2019,
época invernal. La diversidad microbiana aislada fue tolerante
a una concentración tóxica de cobre de 3,1 mM. Del material
particulado, se aisló un mayor número de especies bacterianas
que fúngicas. Sin embargo, las especies fúngicas encontradas
se relacionan con enfermedades nosocomiales. Por tanto, se
propone la concientización de autoridades en el desarrollo de
protocolos y diversas estrategias para la inhibición y control de
brotes de patógenos en centros de salud; así como, la
caracterización de la influencia y efecto de condiciones
climáticas, factores físicos y químicos en función de diversidad
microbiana, especialmente patógena. Así mismo, se propone el
estudio de condiciones extremas de sobrevivencia microbiana
bajo efectos físicos como la radiación UV y efectos químicos
como resistencia a ozono, peróxido de hidrógeno, y
catalizadores como óxido de titanio y demás metales pesados.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen la participación de Carlos Cepeda y
Méd. Wellington Espinoza (INSPI); de la Universidad Agraria
del Ecuador al Ing. Diego Muñoz e Ing. Juan José Sabando.
ANEXOS
Banchon, C. (2019): Fungi found in environmental air at Hospitals. Figshare.
https://doi.org/10.6084/m9.figshare.8572316.v1
Banchon, C. (2019): Meteorology and collected microorganisms. Figshare.
https://doi.org/10.6084/m9.figshare.8785985.v1
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