Año 2020. Número 23.
1
Inhibición del quórum sensing mediante el quórum quenching
en postlarvas de Litopenaeus vannamei
Inhibition of the quorum sensing by quorum quenching in postlarva
of Litopenaeus vannamei
Autores: Jefferson Intriago Angulo
1-2-3
Juan Quimi Mujica
2-3-4
Jordana López Parra
2-3
David Villarreal de la Torre
1
Edmundo Matute
1
Jenny Risco Cunayque
2-3
María Bermúdez Basan
2
Emmerick Motte Darracau
2-3-4
Virna Cedeño Escobar
2-3-4
Eric Mialhe
2-3-4
Dirección para correspondencia: ijeffersonjavier@gmail.com
Recibido: 28-12-2019
Aceptado: 10-04-2020
Resumen
El cultivo del camarón blanco Litopenaeus vannamei es un recurso acuícola de
gran importancia económica a nivel mundial; sin embargo, es severamente
afectado por varios tipos de enfermedades infecciosas, principalmente virales y
bacterianas. Sin embargo las pérdidas masivas reportadas durante los últimos
años, están generalmente relacionadas a infecciones bacterianas en particular,
el síndrome de mortalidad temprana (EMS) y más recientemente relacionada a
la enfermedad de necrosis hepatopancreática aguda (AHPND) por sus siglas en
ingles. Para asegurar la sostenibilidad de la industria del camarón, se debe
1
Facultad Ciencias del Mar. Universidad Laica Eloy Alfaro de Manabí. Ecuador.
2
Biotecnología aplicada al cultivo sostenible de crustáceos. Concept azul S.A Guayaquil-Ecuador.
3
Aplicaciones biotecnológicas al cultivo de crustáceos. Inca Biotec SAC. Tumbes. Perú.
J. Intriago, J. Quimi, J. López, D. Villarreal, E. Matute, J. Risco, M. Bermúdez, E. Motte, V. Cedeño, E. Mialhe
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mejorar la productividad en particular mediante el uso de consorcios de
bacterias probióticas eficientes para la prevención de las enfermedades
bacterianas. Dos consorcios de bacterias probióticas (consorcios comerciales y
consorcio CA), fueron evaluados en pruebas in vitro y en tanques de producción
de post-larvas de camarón L. vannamei, donde se realizó la determinación
subsecuente del grado de inhibición del quórum sensing de las bacterias
patogénicas mediante el quórum quenching de bacterias probióticas y
paralelamente a los análisis de sobrevivencia. Como resultados el consorcio CA
fue el que presento mayor grado de inhibición del quorum sensing in vitro en
paralelo a los mayores porcentajes de sobrevivencia en tanques de producción
de post-larvas de camarón. El mejor efecto probiótico en post-larvas de L.
vannamei resultaron en los tratamientos del consorcio CA, como los mejores
supresores en la presencia de vibrios en el cultivo bacteriológico así como
mayores porcentajes de sobrevivencia en tanques de producción de post-larvas
de camarón.
Palabras clave: Litopenaeus vannamei; quorum sensing; quorum quenching;
bacterias patogénicas; bacterias probióticas
Abstract
The cultivation of white shrimp Litopenaeus vannamei is an aquaculture
resource of great economic importance worldwide; however, it is severely
affected by several types of infectious diseases, mainly viral and bacterial.
However, the massive losses reported in recent years are generally related to
bacterial infections in particular, early mortality syndrome (EMS) and more
recently related to acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND). To ensure
the sustainability of the shrimp industry, productivity must be improved in
particular by the use of efficient probiotic bacteria consortia for the prevention
of bacterial diseases. Two consortia of probiotic bacteria (commercial consortia
and CA consortium) were evaluated in in vitro tests and in post-larvae
production tanks of L. vannamei shrimp, where the subsequent determination
of the degree of inhibition of the quorum sensing of pathogenic bacteria was
carried out. By the quenching quorum of probiotic bacteria and parallel to the
survival analysis. As a result, the CA consortium showed the greatest degree of
inhibition of in vitro quorum sensing in parallel to the higher survival rates in
shrimp post-larval production tanks. The best probiotic effect in post-larvae of
L. vannamei resulted in the CA consortia treatments, as the best suppressors in
the presence of vibrios in the bacteriological culture as well as higher survival
rates in post-larvae shrimp production tanks
Keywords: Litopenaeus vannamei; quorum sensing; quorum quenching;
pathogenic bacteria; probiotic bacteria
Introducción
El cultivo de camarón Litopenaeus vannamei es un recurso acuícola de gran
importancia a nivel mundial y nacional. Sin embargo el cultivo de camarón ha
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Inhibición del quórum sensing mediante el quórum quenching en postlarvas de Litopenaeus vannamei
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sido afectado por enfermedades infecciosas, entre ellas las virales y bacterianas
(Tandel et al., 2017; Lightner et al., 2012; Flegel TW, 2012).
Pero las grandes pérdidas masivas reportadas durante los últimos años, están
generalmente relacionadas a infecciones bacterianas en particular,
mortalidades el síndrome de mortalidad temprana (Early Mortality Syndrome
EMS) y más recientemente relacionada con la enfermedad de necrosis
hepatopancreática aguda EMS/AHPND (early mortality syndrome/acute
hepatopancreatic necrosis disease) (Boonyawiwat et al., 2017).
Estudios epidemiológicos y datos moleculares se han realizado en algunos
países afectados por el síndrome EMS/AHPND, donde Vibrio parahaemolyticus
se caracterizó como causante de la mortal pandemia (Nunan et al., 2014;
Gomez-Gil et al., 2014).
Los plásmidos involucrados en la patogenicidad de V. parahaemolyticus fueron
posteriormente detectados en otras especies de vibrios, sugiriendo que la
transferencia interespecifica de plásmidos podría ocurrir en cultivos de
camarones (Xiao et al., 2017)
En la patogenicidad de vibrio está involucrado el proceso de quórum sensing
que es la comunicación bacteriana regulada por pequeñas moléculas de
señalización difusibles N-acylated homoserine lactones (AHLs) incluyendo C6-
HSL (N-hexanoyl-L-homoserine lactone, HHL) (Fuqua et al., 2001; Ng WL &
Bassler BL, 2009; Kamruzzaman et al., 2010; Defoirdt et al., 2011; Fast &
Tipton, 2012), las cuales activan la expresión de numerosos genes que
controlan diversas funciones como luminiscencia, virulencia, formación de
biofilm esporulación (Bhardwaj et al., 2013).
Sin embargo la inhibición del quórum sensing o quórum quenching ha sido
propuesta como una nueva estrategia para atenuar la patogenicidad
bacteriana, mediante el uso de bacterias probióticas que degraden la señal
involucrada en la detección del quorum sensing (Tinh et al., 2007), así como de
otros beneficios sobre el hospedero, mejorando la asimilación de alimento, valor
nutricional y mejoramiento en la respuesta del huésped ante enfermedades
(Zuo et al., 2018).
Varios estudios relacionados a la inhibición del quórum sensing mediante el
quórum quenching han sido publicados. El equipo de Vinoj et al., (2014)
evaluaron la actividad de quórum quenching de la AHL lactonasa de Bacillus
licheniformis para inhibir la formación de biofilm de Vibrio in vitro y reducir la
colonización intestinal y mortalidad del camarón. Sugiriendo que la actividad
del quórum quenching de B. licheniformis puede ser desarrollado para su uso
como un tratamiento profiláctico para inhibir o reducir la colonización vibrio y
la mortalidad de los camarones en la acuicultura. Además de otros estudios
como de Rayesh et al., (2014); Tang et al, (2015); Augustine et al., (2010).
En el presente estudio se analizó los efectos de consorcios de bacterias
probióticas comerciales y el consorcio CA1 sobre el sobre el grado de inhibición
J. Intriago, J. Quimi, J. López, D. Villarreal, E. Matute, J. Risco, M. Bermúdez, E. Motte, V. Cedeño, E. Mialhe
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del quórum sensing de las bacterias patogénicas y en tanques de producción de
postlarvas de camarón blanco L. vannamei en paralelamente a los análisis de
sobrevivencia
Metodología
Acondicionamiento y siembra de nauplios de L. vannamei
La inoculación de los consorcios de bacterias probióticas se llevó a cabo en el
laboratorio de producción de post-larvas de L. vannamei BAMAR S.A Jama-
Ecuador y en MITOLAB orgánico S.A Salinas-Ecuador. El proceso de
acondicionamiento para el cultivo de post-larvas empezó con la aclimatación de
los nauplios de 36 horas post eclosión (nauplio V) de varios orígenes de
maduración, bajo condiciones adecuadas de temperatura, pH y oxígeno,
posteriormente se realizó la siembra en tanques de 14 y 25 m3 de fibra de
vidrio y recubiertas con geomembrana asegurando las condiciones de la calidad
del agua, la temperatura se mantuvo en promedio de 32 ºC durante todo el
ciclo larvario, y la alimentación estuvo basada en el protocolo interno de
producción de la empresa la cual se maneja por los porcentajes de biomasa, el
recambio de agua fue del 20% diario a partir de los 6 días de iniciado el cultivo.
Obtención y preparación de bacterias probióticas
Las bacterias probióticas del consorcio CA ( 6 cepas de Bacillus spp.) fueron
aisladas a partir de muestras de intestino de camarón blanco nativo silvestre de
acuerdo al protocolo del laboratorio de Biotecnología Concepto Azul S.A., las
cuales fueron cultivadas en caldo Tripticasa Soya (TCS) a 37 ºC durante 24 h,
con agitación. La concentración de bacterias en suspensión del género Bacillus
fue obtenido usando una curva estándar de relación a una densidad óptica de
600 nm. Mientras que las bacterias del tratamiento control son mix de
bacterias probióticas comerciales encontrados en el mercado acuícola listas
para su inoculación en los tanques de producción de post-larvas de camarón
Extraccion de ADN bacteriano
La suspensión bacteriana contenida en los microtubos, serán centrifugadas a
10 000 rpm durante 2 minutos; luego se eliminará el sobrenadante y se re-
suspenderá el sedimento (pellet) en 500 µl de solución PBS 1X. Nuevamente se
centrifugará a 10 000 rpm durante 2 minutos, se eliminará el sobrenadante y
se adicionará 200 µl de solución TE. Las muestras serán llevadas a ebullición
durante 10 minutos e inmediatamente serán colocas en hielo durante 5
minutos. Luego serán centrifugas a 10 000 rpm durante 2 minutos.
Posteriormente se tomará 10 µl del sobrenadante y se colocará en un nuevo
microtubo, y luego se le adicionará 90 µl de agua ultra pura.
Amplificación del gen AHL lactonosa y migración en gel de electroforesis
Se utilizaron primers para el gen AHL lactonasa, forward y reverse aiiAF2 (5´-
CGGAATTCATGACAGTAAAGAAGCTTTA-3´) y aiiAR2 (5´-
CGCTCGAGTATATATTCAGGGAACACTT-3´) (Huma et al., 2011). Las reacción
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de amplificación fue realizada usando una taq ADN polimerasa; para reacciones
de alta fidelidad. Las condiciones de los ciclos de PCR (Polimerase chain
reaction) para la amplificación de la AHL lactonasa de los consorcios de
bacterias probióticas normalmente incluido 95 °C por 5 min, seguido por 30
ciclos de 94 °C por 45 s, 53 °C por 45 s, 72 °C por 1 min, seguido de un solo
ciclo de 72 °C por 8 min.
La migración electroforética de los amplicones (productos de la PCR) se
realizará en geles de agarosa al 2% conteniendo 5 μl de bromuro de etidio (0,5
µg/ml), se utilizará como tampón de migración 120 ml de TAE 1X. Para la
migración se tomará 10 μl de cada amplicon y se mezclará con 2 μl de tampón
de depósito, también se migrará el marcador de peso molecular.
Ensayos in vitro de antagonismo de los consorcios de bacterias probióticas
frente a bacterias patógenas
La prueba de antagonismo se realizó en medio TSA con 2% de ClNa. En cada
placa se sembró 20 μl de cepas de vibrios por método de esparcimiento, se dejó
secar por unos 20 min y luego se le colocaron los discos de papel filtro estériles
y en cada papel filtro se colocó la misma cantidad 20 μl de los consorcios de
bacterias probióticas; se procedió a sellarlas con cinta adhesiva y luego
incubadas a 37 °C por 24 a 48 horas. La zona de inhibición se realizó un
ponderado con la siguiente característica: * nivel leve, ** nivel medio, *** nivel
fuerte de inhibición.
Inoculación de bacterias probióticas en tanques de producción de postlarva de
camaron blanco L. vannamei
En la inoculación de bacterias probióticas en tanques de producción de
postlarvas de camarón L. vannamei, el tratamiento control corresponde al
protocolo de producción del laboratorio BAMAR S.A y MITOLAB S.A donde se
aplican varios consorcios comerciales con una gran variedad de bacterias
probióticas y a una concentración final en la columna de agua de 10
5
UFC/ml.
Sin embargo el tratamiento con el consorcio de bacterias probióticas CA
corresponde a una concentración de 10
4
UFC/ml, entonces 10 veces menos.
Análisis estadístico
La representación de los datos de supervivencia en tanques de producción de
postlarvas de camarón, se realizó con el software InfoStat, con análisis de
varianza ANOVA de una sola vía para analizar las diferencias entre los dos
tratamientos (P<0,05); asimismo, se comprobó las diferencias entre
tratamientos con el test de Tukey y LSD.
Resultados
PCR del gen AHL lactonasa
La prueba de PCR fue realizada para el gen AHL lactonasa de los diferentes mix
de bacterias probióticas, donde el consorcio CA dio positivo para AHL
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lactonasa, mientras que los mix de bacterias comerciales dio positivo para
algunos casos como se detalla en la tabla 1
Tabla 1.- PCR del gen AHL lactonasa. Consorcio de bacterias probióticas comerciales y el consorcio de bacterias
probióticas CA
PCR de diferentes consorcios de bacterias probióticas
Mix # 1
Mix # 2
Mix # 3
Mix # 4
Mix # 5
Mix CA
Gen AHL
lactonasa
Positivo
(+)
Negativo
(-)
Negativo
(-)
Positivo
(+)
Positivo
(+)
Positivo
(+)
Fuente: Obtenido de la migración en gel de agarosa al 2% en el laboratorio Inca Biotec SAC
Pruebas de antagonismo entre consorcios de bacterias probióticas con bacterias
patogénicas
En cuanto a los ensayos de antagonismo entre consorcio de bacterias
probióticas con bacterias patógenas, el consorcio CA tuvo mejores niveles de
inhibición, así teniendo los mayores halos de inhibición contra V. harveyi, V.
nigripluchritudo, V. parahaemolypticus y el menor halo de inhibición contra V.
brasiliens. Mientras que los consorcios de bacterias probióticas comerciales
tuvieron menores halos de inhibición en comparación al consorcio CA (tabla 2,
figura 1).
Tabla 2.- Nivel de inhibición entre los consorcios de bacterias probióticas con vibrios patógenos. consorcio de
bacterias probióticas comerciales encontrados en el mercado acuícola y el consrocio de bacterias probióticas CA.
Nivel de inhibición leve (*), nivel de inhibición medio (**), nivel de inhibición fuerte (***)
Mix #
1
Mix #
2
Mix #
4
Mix #
5
Mix
CA
V. sinaloensis
**
**
**
V. harveyi
*
***
V. nigripulchritudo
**
**
***
V. brasiliensis
*
*
V. parahaemolypticus
*
**
*
*
***
V. alginolypticus
***
**
**
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Figura 1.- Inhibición entre los consorcios de bacterias probióticas contra vibrios patógenos. Cultivo en placas en
medio TSA de los consorcios de bacterias probióticas comerciales encontrados en el mercado acuícola y el consorcio
de bacterias probióticas CA
Porcentaje de supervivencia de postlarvas en tanques de producción de
postlarvas de L. vannamei
El ensayo en la empresa BAMAR S.A el tratamiento CA, fue el que presento
mayores porcentajes de supervivencia en tanques de producción de post-larvas
de camarón L. vannamei, siendo en el mes de septiembre con nauplios de
origen del laboratorio de maduración BAMAR S.A, con el mayor porcentaje de
supervivencia, donde se obtuvo una diferencia del 14% en comparación con el
grupo control como se puede observar en la figura 2. Sin embargo la
inoculación del consorcio CA no tuvo diferencias significativas en comparación
al tratamiento control
Mientras que en la empresa MITOLAB S.A el tratamiento CA, fue quien mostró
mayores porcentajes de supervivencia siendo en el mes de octubre con nauplios
de origen del laboratorio de maduración # 3 con el mayor porcentaje de
supervivencia, donde se obtuvo una diferencia significativa del 18% en
comparación con el grupo control y la menor supervivencia en el mes de
septiembre con los nauplios de origen del laboratorio de maduración # 1, esto
último se debió a la variación de temperatura que origino un estrés en el cultivo
larvario teniendo, el tratamiento con CA presentó una mejor supervivencia con
una diferencia del 5% en comparación con el tratamiento control (figura 2)
Además debemos señalar que se realizó la prueba de supervivencia a cambios
bruscos de salinidad de 30 a 0 ppt, teniendo como resultado obtenido que las
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larvas inoculadas con el consorcio de bacterias probióticas CA tuvo menos
porcentajes de mortalidad en comparación al grupo control.
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
Figura 2.- Porcentaje de sobrevivencia de postlarvas de L. vannamei en tanques de producción del laboratorio
BAMAR y MITOLAB. - Barras estadísticas en InfoSTAT con porcentajes de producción de postlarvas de camarón
con diferentes orígenes de nauplio y con la inoculación del consorcio CA y grupo control en diferentes meses del
año. Prueba de comparación de medias utilizando el método de Tukey (valor p> 0,05)
Discusión
Los agentes patógenos dependen del quórum sensing, pequeñas moléculas de
señalización que activan la expresión de numerosos genes que controlan
diversas funciones como luminiscencia, virulencia, formación de biofilm
esporulación. La inhibición del quórum sensing o quórum quenching puede ser
usado como una nueva estrategia para atenuar la virulencia bacteriana
(Bhardwaj et al., 2013).
En nuestros datos el consorcio de bacterias probióticas CA tuvo fuertes niveles
de inhibición contra vibrios. Siendo el género Vibrio un patógeno potencial para
el camarón, y en brotes son causantes de vibriosis dando lugar a grandes
pérdidas económicas para el sector camaronero (Hong et al., 2016; Xiao et al.,
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2017; Moreno et al., 2017). Este estudio contrasta con los resultados obtenidos
por Vinoj et al., (2014) y Rayesh et al., (2014).
Además la determinación de la relación huésped-microbiota de las bacterias
intestinales ayuda a identificar microorganismos de posibles desempeño como
agentes probióticos, los cuales son utilizados cada vez más como un medio
alternativo para prevenir el uso de antibióticos en la crianza de animales
acuáticos (Nayak SK, 2010; Chai et al., 2016).
En cuanto los probióticos de Bacillus han atraído una mayor atención científica
y comercial; Recientemente, se añaden rutinariamente a alimentos funcionales
que promueven la salud como suplementos terapéuticos, profilácticos y de
crecimiento. Algunas de sus ventajas potenciales incluyen la colonización de
microorganismos específicos en el intestino para restaurar el equilibrio
microbiano intestinal (Schryver & Vadstein, 2014), ejerciendo numerosos
efectos beneficiosos en el huésped de los cuales ayuda promover el crecimiento
y la respuesta inmune del huésped.
Siendo la supervivencia es uno de los factores más importantes en la industria
acuícola del camarón y está estrechamente ligada en la determinación de la
calidad y potencial de los probióticos.
Sin embargo, en el análisis estadístico de las tasas de supervivencia del ensayo
de inoculación del consorcio de bacterias probióticas CA en tanque de
producción de postlarvas de los laboratorio BAMAR y MITOLAB orgánico S.A,
no existió diferencias significativas en comparación al tratamiento control del
mismo origen del nauplio y mes de producción, No obstante, existió diferencias
significativas en el número de bacterias probióticas inoculadas en el cultivo
larvario ya que las empresas BAMAR y MITOLAB utilizan varios productos
comerciales con gran variedad de bacterias probióticas mientras que el
consorcio CA solo es de 6 cepas de Bacillus spp. sugiriendo que el consorcio CA
tiene fuertes actividades probióticas.
Estos datos tienen relación con los resultados de Sánchez-Ortiz et al., (2016),
quienes aislaron y mezclaron especies del géneros de Bacillus obtenidos de
Anadara tuberculosa para ser evaluados en la influencia en el crecimiento,
supervivencia, prevalencia y expresión de genes relacionados a la inmunidad en
el camarón blanco L. vannamei Liu et al., (2015), quienes aislaron y
caracterizaron Bacillus spp. antagonistas a Vibrios spp. para su uso como
probióticos en acuicultura.
Conclusiones
El mejor efecto probiótico en post-larvas de L. vannamei resultaron en los
tratamientos del mix de bacterias probióticas CA, como los mejores supresores
en la presencia de vibrios en el cultivo bacteriológico así como mayores
porcentajes de sobrevivencia en tanques de producción de post-larvas de
camarón. Sugiriendo que puede ser usado como agente de bio-control contra
las infecciones por vibrios.
J. Intriago, J. Quimi, J. López, D. Villarreal, E. Matute, J. Risco, M. Bermúdez, E. Motte, V. Cedeño, E. Mialhe
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La Técnica. Publicación semestral. Vicerrectoría Académica. Universidad Técnica de Manabí, ECUADOR