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Introducción

La Amazonía ecuatoriana es considerada como una de las regiones con más biodiversidad del planeta (Cartay y Chaparro, 2020), la enorme variedad de plantas que allí se encuentran ha despertado gran interés por la investigación, tanto en la industria alimentaria como en la obtención de materias primas para las industrias cosmética y farmacéutica (Noriega et al., 2022). La mayoría de las especies que se encuentran en Ecuador son desconocidas para la ciencia contemporánea, sin embargo, debido a sus múltiples beneficios terapéuticos, históricamente diversas comunidades indígenas han empleado distintas plantas con estos fines, como en el caso de I. guayusa (Lozano et al., 2020).

Ilex guayusa es una planta oriunda de la región amazónica de Ecuador y ha despertado gran interés en todo el mundo debido a sus características antioxidantes, energéticas y estimulantes (Wise y Negrin, 2020). Algunos autores, tales como Patiño (1968); Bennett y Alarcón (2015); Wise y Santander (2018) han investigado los usos etnobotánicos de I. guayusa e identificado evidencias del uso medicinal y ritual de la misma desde la época colonial, así como informaciones relacionadas a su seguridad como ingrediente de bebidas tradicionales. Por ende, la especie se presenta como un producto promisorio para la economía del sector amazónico ecuatoriano, siendo al mismo tiempo un enlace con la tradición local y un vector de sistemas productivos que reducen la deforestación, los que han sido considerados amigables con el ambiente (Radice et al., 2015; Torres et al., 2017).

Aunque esta planta se encuentra con poca frecuencia en las chacras, los cultivos comerciales están aumentando constantemente como resultado del enorme interés que ha generado. Sus hojas son utilizadas por los pueblos indígenas de la Amazonía ecuatoriana, en su mayoría de las provincias de Pastaza y Napo, para preparar decocciones antes de realizar ritos en los que participan los ciudadanos de cada localidad (Andrade et al., 2019). Esta especie es una de las pocas plantas que contienen cafeína y compuestos polifenólicos, que recientemente se ha empleado como planta estimulante y terapéutica (Intriago et al., 2022).

Con base a su biomasa seca, la cantidad de cafeína en I. guayusa puede variar de 2,90 a 3,28% (Villacís-Chiriboga, 2017) y, además, se ha señalado la presencia de una variedad de polifenoles como el ácido clorogénico y quercetina-3-O-hexosa, compuestos reconocidos por su actividad antioxidante (Castañeda et al., 2022). Aun cuando los compuestos polifenólicos y la cafeína han sido ampliamente estudiados como ingredientes activos para alimentos funcionales, medicamentos y cosméticos (Radice et al., 2017), y aunque existen muchos productos elaborados a partir de la especie I. guayusa (Mena, et al., 2019), ninguno tiene un alto valor agregado obtenido mediante técnicas agroindustriales de vanguardia que aseguren una mayor estabilidad y aprovechamiento. En este sentido, el objetivo de la investigación fue elaborar un preparado hidrosoluble en forma de sólido pulverulento a partir de extractos acuosos de la especie I. guayusa, considerando que por su elevado contenido de cafeína y polifenoles lo convierte en un ingrediente importante para bebidas energizantes o alimentos funcionales.

Materiales y métodos

La investigación se realizó en la Universidad Estatal Amazónica (UEA) ubicada en el km 2½ vía al Tena, provincia Pastaza con una altitud de 940 msnm. Además, se contó con el apoyo del Laboratorio de Investigación de la Facultad de Alimentos, Universidad Técnica de Ambato, ubicada en el Campus Huachi, en la avenida los Chasquis y Río Payamino ciudad de Ambato, Tungurahua, Ecuador; donde se llevó a cabo el proceso de spray drying.

Material vegetal

Las hojas secas de I. guayusa se adquirieron en la Fundación Chankuap, ubicada en el barrio Simón Bolívar de la ciudad de Macas, Ecuador empacadas en sobres de 35 g.

Diseño experimental

La primera fase del trabajo se enmarcó en un diseño experimental factorial con dos variables independientes: tiempo y relación sólido líquido, y dos niveles con punto intermedio, para optimizar la operación de decocción donde se evaluó como variables de respuesta el contenido de cafeína y el de polifenoles totales, determinados mediante el método espectrofotométrico. Finalmente se estableció el mejor tratamiento en función de la concentración de cafeína y polifenoles totales. Se analizaron los datos mediante el software Design Expert (Melo y López, 2020). En la tabla 1 se plantea el diseño experimental realizado.

agua destilada dejando en reflujo por 15; 22,5 y 30 min, dependiendo del diseño experimental y de la muestra sometida a análisis. Luego se filtró en caliente y se dejó enfriar para realizar el análisis espectrofotométrico. El volumen final del extracto se completó a 100 mL con agua destilada.

Determinación espectrofotométrica de cafeína

Para el análisis se alcalinizaron los 100 mL del extracto acuoso con 1 mL de NaOH 0,1 M, después se extrajo la cafeína con dos porciones de cloroformo de 15 mL cada una. Finalmente, se mezclaron los extractos clorofórmicos y se evaporó en baño María. Luego se disolvió la cafeína añadiendo 50 mL de agua destilada caliente (60-90 °C), se enfrió, se colocó a un matraz aforado de 100 mL y se completó el volumen con agua destilada. De la disolución anterior, se tomaron 5 mL hacia un matraz aforado de 25 mL, se agregó 1 mL de HCl 0,01 M y se enrasó con agua destilada. Finalmente, la absorbancia de la muestra fue leída a una longitud de onda de 275 nm (Sanabria et al., 2017) y se calculó la concentración de cafeína en la muestra por el método del patrón externo a partir de la ecuación (1).

Donde, Cm: concentración de la muestra (cafeína), Am: absorbancia de la muestra, Cp: concentración del patrón (mg·L-1) y Ap: absorbancia del patrón.

Determinación espectrofotométrica de compuestos polifenólicos totales

A partir de la disolución filtrada en caliente, se tomó 1 mL del extracto en un matraz aforado de 10 mL y se agregó 0,5 mL del reactivo Folin-Ciocalteu diluido a la mitad con agua destilada y se dejó en reposo por 5 min, posteriormente se adicionó 0,5 mL de carbonato de sodio al 20% y se enrasó con agua destilada; se agitó, se protegió de la luz por 30 min a temperatura ambiente. Finalmente, la absorbancia se midió a 765 nm en el espectrofotómetro (Muñoz-Bernal et al., 2017).

El contenido total de polifenoles se determinó utilizando una curva de calibración de ácido gálico y la concentración de polifenoles totales se expresó en miligramos equivalentes de ácido gálico, para ello se empleó la siguiente ecuación, obtenida a partir del modelo matemático de la recta de calibrado de la ecuación (2).

Donde, A: absorbancia de la muestra, C: concentración de la muestra (mg·L-1).

Obtención y evaluación del extracto seco de I. guayusa

El extracto seco de I. guayusa se obtuvo aplicando la tecnología de spray drying, según procedimiento descrito en la figura 1 (Pereira et al., 2018). El producto obtenido se evaluó a través de los parámetros: pH, solubilidad en agua fría y caliente, metales pesados y análisis microbiológico de coliformes y Escherichia coli.

Determinación de pH

Se determinó con la ayuda de un pH-metro, se pesó 1 gramo de la muestra pulverizada de I. guayusa obtenidas por spray drying, se disolvió en 15 mL de agua destilada y se midió el valor de pH.

Determinación de cenizas totales

Se pesó 1 g de muestra obtenida por spray drying por duplicado en un crisol, para luego colocarlas en una plancha de calentamiento a 500 °C para carbonizarla, seguidamente se situaron los crisoles en una mufla a una temperatura de 550 °C por un tiempo de 5 horas, después de haberse cumplido el tiempo, con ayuda de pinzas metálicas se procedió a retirar las muestras y se dejó enfriar en un desecador por una 1 hora. El cálculo de las cenizas totales se realizó utilizando la ecuación (3).

Donde, C: porcentaje de cenizas totales, M1: masa del crisol más la muestra incinerada (g), M2: masa del crisol más la muestra fresca (g), m: masa del crisol vacío (g).

Determinación de solubilidad en caliente y en frío

En caliente: se pesaron 2,5 g de muestra en un vaso de precipitación de 500 mL y se disolvieron en 250 mL de agua desmineralizada acabada de hervir. Se agitó moderadamente y se registró el tiempo hasta la total disolución, evidenciado visualmente.

En frío: Se realizó de la misma manera que en caliente, pero utilizando agua desmineralizada a 16 °C±2 °C.

Determinación de microorganismos mesófilos y coliformes totales

Para la determinación de mesófilos totales y coliformes se utilizó el método de las diluciones sucesivas y la siembra por extensión, utilizando como medios de cultivo respectivamente el Plate Count Agar (PCA) y el Chromocult.

Los análisis se realizaron a partir de una disolución madre preparada mezclando 1 g de sólido pulverulento de I. guayusa

con 9 mL de agua destilada estéril. A partir de esta disolución se realizaron las diluciones sucesivas hasta la dilución 10:4. De las diluciones 10:3 y 10:4 se tomaron 100 µL por repetición y se sembraron en cajas Petri, previamente preparadas. Por cada dilución se consideraron tres repeticiones. Para la determinación de coliformes totales se sembró directamente de la disolución madre ya que el objetivo no era cuantificar, sino determinar la presencia/ausencia de dichas bacterias. Las cajas se incubaron a una temperatura de 37 °C por un tiempo de 48 h, para los microorganismos mesófilos y a 25 °C por 48 h, para los coliformes. Transcurridas las 48 h se observaron las cajas para determinar si había crecimiento y se consideraron, para fines de conteo, exclusivamente las cajas Petri con número de colonias entre 30 y 300 UFC·mL-1. Para las bacterias coliformes se utilizó la tabla colorimétrica para interpretar los resultados, adjunta al medio de cultivo Chromocult. De hecho, en este medio de cultivo, las distintas especies de coliformes aparecen de diferentes colores, lo cual es un carácter taxonómico que permite reconocer de qué bacteria se trata.

Determinación de cobre, plomo, hierro y zinc mediante espectrofotometría de absorción atómica

Para el tratamiento por digestión se pesó 0,5 g de las muestras obtenidas por spray drying, luego se adicionó 1 mL de peróxido de hidrógeno y 7 mL de ácido nítrico (HNO3) concentrado, seguidamente se colocaron los pocillos con las muestras en el equipo de sistema de digestión de muestras asistida por microondas por un tiempo de 1 hora y 30 minutos. Después se colocaron las muestras en matraces de 50 mL y se aforó con HNO3 (1 M). Finalmente, se procedió a la respectiva lectura en el espectrofotómetro de absorción atómica para determinar la concentración de los metales Cu, Zn, Fe y Pb. Para la cuantificación se utilizó el método de la curva de calibración, a través de la expresión de cálculo (4).

Donde, m: concentración del metal a determinar (mg·kg-1), PPM: concentración de la disolución de ensayo (mg·L-1), FDI: factor de dilución, M: biomasa de la muestra (g).

Resultados y discusión

Evaluación del diseño de experimentos

Respecto a la variable de respuesta: concentración de cafeína, los resultados del efecto de los factores tiempo y relación sólido-líquido sobre la extracción de cafeína obtenida mediante de la decocción de las hojas de I. guayusa, variaron entre 62,98-71,70 mg·L-1 y se calcularon en función de la biomasa seca. Los valores de cada combinación se presentan en la tabla 2.

Factores que afectan la extracción de los polifenoles totales

La concentración de los compuestos polifenólicos totales fluctuó entre 33,0-55,76 mg·L-1 expresado sobre la base del ácido gálico. A continuación, se presenta la tabla 4 con los resultados obtenidos en cada combinación de los factores de estudio.

Experimento	A	B	Cafeína
Experimento	Tiempo (min)	S/L (g·mL-1)	Concentración (mg·L-1)
1	15	5/100	65,96
2	15	5/100	64,47
3	15	5/100	65,30
4	15	15/100	67,87
5	15	15/100	68,30
6	15	15/100	66,81
7	22,5	10/100	68,94
8	22,5	10/100	66,81
9	22,5	10/100	67,66
10	30	5/100	62,98
11	30	5/100	64,68
12	30	5/100	64,04
13	30	15/100	71,49
14	30	15/100	71,70
15	30	15/100	68,72

Fuente	Suma de cuadrados	gl	Cuadrados medios	Valor F	p-valor Prob > F)
Modelo	78,84	3	26,28	21,05	< 0,0001	Significativo
A-Tiempo	2,00	1	2,00	160	0,2317
B-SL	62,84	1	62,84	50,33	< 0,0001
AB	14,00	1	14,00	11,21	0,0065
Residual	13,73	11	1,25
Falta de ajuste	2,14	1	2,14	1,84	0,2046	No significativo
Error puro	11,60	10	1,16
Total corregido	92,57	14

Experimento	A	D	PT
Experimento	Tiempo (min)	S/L (g·mL-1)	Concentración (mg·L-1)
1	15	5/100	33,0
2	15	5/100	33,3
3	15	5/100	34,4
4	15	15/100	40,5
5	15	15/100	41,5
6	15	15/100	39,3
7	22,5	10/100	39,1
8	22,5	10/100	39,6
9	22,5	10/100	39,9
10	30	5/100	28,2
11	30	5/100	31,2
12	30	5/100	30,9
13	30	15/100	50,9
14	30	15/100	55,8
15	30	15/100	52,5

Fuente	Suma de cuadrados	gl	Cuadrados medios	Valor F	p-valor (Prob > F)
Modelo	921,92	3	307,31	152,71	< 0,0001	Significativo
A-Tiempo	62,75	1	62,75	31,18	0,0002
B-SL	665,73	1	665,73	330,82	< 0,0001
AB	193,44	1	193,44	96,13	0,0001
Residual	22,14	11	2,01
Falta de ajuste	0,15	1	0,15	0,066	0,8019	No significativo
Error puro	21,99	10	2,20
Total corregido	944,06	14

Análisis microbiológicos

Los resultados de los análisis microbiológicos mostraron que los extractos obtenidos, por spray drying, no tuvieron presencia de coliformes ni microorganismos mesófilos, ya que no fueron observadas colonias en los cultivos de control.

Es importante destacar que los metabolitos secundarios de I. guayusa pueden contribuir a los efectos favorables de las bebidas y comidas que contienen metilxantina de dos maneras: primero, al trabajar en sinergia con la cafeína y la teobromina para producir efectos positivos, y segundo, al reducir los efectos negativos de la cafeína. Aunque hay poca información sobre estudios en humanos, los primeros estudios en ratas indicaron que el uso de cafeína retardaron los efectos del envejecimiento en la función cognitiva (Schuster y Mitchell, 2019).

Teniendo en cuenta los diferentes tratamientos, en la presente investigación se lograron niveles de extracción de cafeína que resultaron en un valor de concentración máxima de 71,70 mg·L-1 (1,43 mg·g-1). Una investigación desarrollada por Wise y Santander (2018) señaló valores de cafeína de 19,08 mg·g-1 en hojas secas de I. guayusa; el mismo estudio señaló que las investigaciones realizadas por otros autores mostraron una amplia gama de valores de concentración de cafeína (8,13-75,8 mg·g-1), lo que sugirió que se necesita más investigación para comprender completamente la variabilidad del contenido de cafeína en las hojas de I. guayusa. La cantidad de cafeína en las hojas puede variar según la edad de la planta, su ubicación, el clima, el suelo y cómo se cosecha (por un solo corte o por cosechas posteriores) (Montaño et al., 2019).

Según una investigación de Chianese et al. (2019), los triterpenoides pentacíclicos contenidos en I. guayusa tuvieron una amplia variedad de modos de acción, así como una gran cantidad de componentes activos. Según García-Ruiz et al. (2017), las hojas de I. guayusa contuvieron alrededor de 14 compuestos fenólicos, así mismo, demostraron que tuvo una fuerte capacidad antioxidante utilizando las técnicas analíticas DPPH y ORAC. Según Gan et al. (2018) los extractos de hojas de I. guayusa elaborados con etanol presentaron una alta concentración de flavonoides y fenoles. La técnica DPPH fue utilizada por Villacís-Chiriboga et al. (2018) para cuantificar 14 compuestos fenólicos diferentes y siete carotenoides diferentes, siendo la luteína la más representativa de este último grupo. La cantidad total de polifenoles de la I. guayusa, según un estudio de Pardau et al. (2017) varió entre 54,39 y 67,23 mg·g-1. Los autores descubrieron que las sustancias principales contenidas en esta especie fueron derivados del ácido cafeoil-quínico mediante el uso de una técnica espectrofotométrica. La actividad antioxidante de los extractos de I. guayusa estuvo directamente correlacionada con la presencia de los compuestos antes mencionados.

Conclusiones

Se obtuvo un preparado hidrosoluble en forma de extracto seco a partir de extractos acuosos de la especie I. guayusa, aplicando la técnica spray drying. El preparado representó un ingrediente basado en una especie amazónica para nuevas bebidas funcionales. Las mejores condiciones para obtener un extracto acuoso rico en cafeína y polifenoles totales son las que prevén 15 g de hojas secas de I. guayusa en 100 mL de agua desmineralizada llevadas a decocción por 30 min.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de interés en la presente publicación en ninguna de sus fases.

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Variable independiente	Nivel de variable codificada
Variable independiente	Símbolo	Bajo	Central	Alto
		-1	0	1
Relación sólido líquido (g·100 mL-1)	A	5	10	15
Tiempo (min)	B	15	22,5	30

Parámetro	Guayusa	Café
		Mínima	Máxima
pH	5,5	4,7	5,5
Cenizas totales	13,87%	-	14%
Solubilidad en agua caliente	30 s	-	30 s
Solubilidad en agua fría	3 min	-	3 min

Parámetro	Guayusa (mg·kg-1)	Café (mg·kg-1)
		Mínimo	Máximo
Cobre	12,35	-	20
Plomo	N/D	-	1
Zinc	234,5	-	50

Autor	Contribución
Sting Brayan Luna-Fox	Revisión bibliográfica, parte experimental de la investigación, análisis e interpretación de los datos, preparación y redacción y edición del manuscrito.
Reinaldo Rigoberto Álvarez Castro	Revisión bibliográfica, parte experimental de la investigación, análisis e interpretación de los datos.
Nelly Jazmín Peñafiel-Bonilla	Revisión bibliográfica, participación en la redacción del manuscrito.
Matteo Radice	Revisión bibliográfica, diseño de la investigación, análisis de datos y corrección de estilo.
Laura Scalvenzi	Análisis microbiológicos, experimentación y redacción de dicha sección.
Yasiel Artega-Crespo	Análisis estadísticos y edición del manuscrito.
Orestes Darío López Hernández	Obtención del producto mediante spray drying.
Luis Ramón Bravo-Sánchez	Diseño de la investigación, colaboración en análisis químicos, análisis e interpretación de los datos, preparación y redacción y edición del manuscrito.