PERFIL FISICOQUÍMICO DE VINO BLANCO PRODUCIDO CON CEPAS RESULTANTES DE LA FUSIÓN DE PROTOPLASTOS
DE LEVADURAS (SACCHAROMYCES CEREVISIAE Y HANSENIASPORA GUILLIERMONDII)
Publicación Cuatrimestral. Vol. 4, No 2, Mayo/Agosto, Año 2019, Ecuador (p. 1-20) 1
Publicación Cuatrimestral. Vol. 4, No 2, Mayo/Agosto, 2019, Ecuador (p. 1-20)
PERFIL FISICOQUÍMICO DE VINO BLANCO PRODUCIDO CON
CEPAS RESULTANTES DE LA FUSIÓN DE PROTOPLASTOS DE
LEVADURAS (SACCHAROMYCES CEREVISIAE Y
HANSENIASPORA GUILLIERMONDII)
Dra. Karelen Araujo
1*
, Dra. Ana Cáceres
2
, Dra. María Berradre
3
, MSc. Zulay
Mármol
1
, MSc. Johanna Raga
1
, MSc. Marisela Rincón
1
.
1
Laboratorio de Tecnología de Alimentos y Fermentaciones Industriales. Escuela de Ingeniería Química. Facultad
de Ingeniería. Universidad del Zulia. Venezuela.
2
Laboratorio de Desarrollo de Métodos de Análisis. Departamento de Química. Facultad Experimental de
Ciencias. Universidad del Zulia. Venezuela.
3
Laboratorio de Alimentos. Departamento de Química. Facultad Experimental de Ciencias. Universidad del Zulia.
Venezuela.
*Autor para correspondencia: karelenaraujo@gmail.com
Recibido: 16-01-2019 / Aceptado: 20-05-2019 / Publicación: 30-05-2019
Editor Académico: Dr. Máximo Aurelio Gallignani Bernardi
RESUMEN
El sector vitivinícola mundial se encuentra inmerso en un importante proceso de actualización y renovación. En
este contexto es interesante resaltar la actividad y la innovación de muchas bodegas que experimentan con nuevas
variedades de uva, la utilización de uvas y levaduras autóctonas, así como con nuevas tecnologías para producir
vinos más adaptados al gusto del consumidor. Todos estos cambios conllevan al desarrollo de nuevos productos
con propiedades únicas que requieren de un estricto control de calidad. El objetivo del presente trabajo es
determinar el perfil fisicoquímico de un vino blanco producido mediante fermentación alcohólica de cepas
resultantes de la fusión intergénica de protoplastos de la levadura autóctona Saccharomyces cerevisiae
SCVMLUZ 2008 y la levadura comercial Hanseniaspora guilliermondii CECT 11102 (Colección Española de
Cultivos Tipo). Se realizaron vinificaciones en blanco con mosto de uva de la variedad Malvasía. Se realizaron
los siguientes análisis físico-químicos como sólidos solubles, azúcares, pH, densidad relativa, acidez titulable y
volátil, dióxido de azufre total, dióxido de azufre libre y etanol. La cinética de consumo de los azúcares fue más
rápida en los bioprocesos realizados con S. cerevisiae y la levadura híbrida (SCHLUZ2014). Todas las levaduras
de estudio consumieron glucosa a mayor velocidad que fructosa. Los resultados obtenidos indican que el vino
obtenido con la cepa híbrida cumple con los estándares establecidos por las Organizaciones Nacionales e
Internacionales.
Palabras clave: vino blanco, levadura hibrida, consumo de azucares, características fisicoquímicas.
PHYSICOCHEMICAL PROFILE OF WHITE WINE PRODUCED
WITH STRAINS RESULTING FROM THE FUSION OF YEAST
PROTOPLASTS (SACCHAROMYCES CEREVISIAE AND
HANSENIASPORA GUILLIERMONDII)
Artículo de
Investigación
Ciencias Químicas
Dra. Karelen Araujo, Dra. Ana Cáceres, Dra. María Berradre, MSc. Zulay Mármol, MSc. Johanna Raga, MSc. Marisela Rincón
2
ABSTRACT
The world wine sector is immersed in an important process of updating and renewal. In this context, it is interesting
to highlight the activity and innovation of many wineries experimenting with new grape varieties, the use of native
grapes and yeasts, as well as new technologies to produce wines more adapted to the taste of the consumer. All
these changes lead to the development of new products with unique properties that require a strict quality control.
The objective of this work is to determine the physicochemical profile of white wine produced by alcoholic
fermentation of strains resulting from the intergenic fusion of protoplasts of the indigenous yeast Saccharomyces
cerevisiae SCVMLUZ 2008 and the commercial yeast Hanseniaspora guilliermondii CECT 11102 (Colección
Española de Cultivos Tipo) White vinifications were made with grape must of the Malvasia variety. The following
physical-chemical analyzes were carried out: soluble solids, sugars, pH, relative density, titratable and volatile
acidity, total and free sulfur dioxide and ethanol. The kinetics of sugar consumption was faster in the bioprocesses
performed with S. cerevisiae and the hybrid yeast (SCHLUZ2014). All the study yeasts consumed glucose at a
faster rate than fructose. The results obtained indicate that the wine obtained with the hybrid strain complies with
the standards established by the National and International Organizations.
Key words: Key words: white wine, hybrid yeast, consumption of sugars, physicochemical characteristics.
PERFIL FÍSICO-QUÍMICO DO VINHO BRANCO PRODUZIDO COM
STRAINS RESULTANTES DA FUSÃO DE PROTOPLASTROS DE
LEVEDURA (SACCHAROMYCES CEREVISIAE AND
HANSENIASPORA GUILLIERMONDII)
RESUMO
O setor vitivinícola mundial está imerso em um importante processo de atualização e renovação. Neste contexto,
é interessante observar a atividade e inovação de muitas adegas que experimentam com novas variedades de uva,
a partir de uvas e leveduras, bem como novas tecnologias para produzir melhor adaptado aos vinhos gosto do
consumidor. Todas essas mudanças levam ao desenvolvimento de novos produtos com propriedades únicas que
exigem um rigoroso controle de qualidade. O objectivo deste estudo é determinar o perfil físico-química de um
vinho branco produzido por fermentação alcoólica de estirpes resultantes da fusão de protoplastos intergénica da
levedura Saccharomyces cerevisiae SCVMLUZ 2008 nativas e levedura Hanseniaspora guilliermondii CECT
comercial 11102 (Colección Española de Cultivos Tipo) . Vinificações brancas foram feitas com mosto de uva da
variedade Malvasia. o seguinte teor de sólidos solúveis de análise físico-química, açúcares, pH, a gravidade
específica, a acidez titulável e de dióxido de enxofre volátil, total e livre e de etanol foram feitas. A cinética de
consumo de açúcar foi mais rápido em bioprocessos realizados com S. cerevisiae e leveduras híbrido
(SCHLUZ2014). Todas as leveduras do estudo consumiram glicose a uma taxa mais rápida do que a frutose. Os
resultados obtidos indicam que o vinho obtido com a cepa híbrida está em conformidade com os padrões
estabelecidos pelas Organizações Nacionais e Internacionais.
Palavras chave: vinho branco, levedura híbrida, consumo de açúcares, características físico-químicas.
Citación sugerida: Araujo, K., Cáceres, A., Berradre, M., Mármol, Z., Raga, J., Rincón, M. (2019). Perfil
fisicoquímico de vino blanco producido con cepas resultantes de la fusión de protoplastos de levaduras
(saccharomyces cerevisiae y hanseniaspora guilliermondii). Revista Bases de la Ciencia, 4(2), 1-20. DOI:
https://doi.org/10.33936/rev_bas_de_la_ciencia.v4i2.1599 Recuperado de:
https://revistas.utm.edu.ec/index.php/Basedelaciencia/article/view/1599
Orcid IDs:
Karelen Araujo: https://orcid.org/0000-0002-6505-8348
Máximo Aurelio Gallignani Bernardi: https://orcid.org/0000-0002-1662-8156
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1. INTRODUCCIÓN
La biotecnología enológica busca la obtención de vinos más atractivos y complejos desde el
punto de vista organoléptico con el objetivo de obtener vinos de alta calidad, cuyas propiedades
coincidan con las preferencias sensoriales de los consumidores. Las principales características
de un buen vino están determinadas por el color, la densidad, el sabor y el aroma (Berbegal et
al., 2017).
La especie predominante para la elaboración de vino es Saccharomyces cerevisiae, debido a
que fermenta casi en su totalidad a los azúcares del medio y produce altas concentraciones de
etanol. Sin embargo, sus características son simples y comunes, mientras que las levaduras del
género no-Saccharomyces poseen características enológicas que pueden tener influencia sobre
las propiedades sensoriales de los vinos. No obstante, estas cepas no fermentan eficientemente
el mosto de la uva debido a que son poco tolerantes al etanol, son sensibles al dióxido de azufre
y producen concentraciones elevadas de ácido acético. Por estas razones no son empleadas
como cultivos iniciadores en las fermentaciones, pero pueden ser utilizadas exitosamente como
una cepa parental en los procesos de mejoramiento de una levadura (Raineiri & Pretorius, 2000;
Mateo & Maicas, 2016).
Los enólogos reconocen el importante papel de S. cerevisiae. Existe una creciente demanda de
nuevas cepas de levaduras que se adapten mejor a las diferentes regiones vitícolas, a las
variedades de la uva, a las prácticas culturales y a las condiciones de vinificación (Van
Rensburg, 2006). Es por ello que centenares de cepas de esta especie se han generado mediante
procesos de mutación y selección, los cuales se adaptan a diferentes mostos.
En este orden de ideas, durante los últimos años se han llevado a cabo modificaciones dirigidas
al estudio del genoma de cepas vínicas mediante experimentos de mutagénesis y selección,
hibridación, electroporación, tratamiento con sales de litios, citoducción o fusión de
protoplastos (Pretorius, 2000; Carrascosa et al., 2005). La fusión de protoplastos se basa en el
rompimiento de la pared celular para producir la fusión de las membranas de dos o más células,
dando lugar a un híbrido somático. Esta técnica es versátil, económica y tiene un gran potencial
para procesos de mejora de cepas debido a que puede ser utilizada para producir híbridos
interespecíficos e intergénicos (Murlidhar & Panda, 2000).
En un trabajo previo realizado por los autores se obtuvo mediante la técnica de fusión de
protoplastos una cepa híbrida intergénica con potencialidades enológicas (Araujo et al., 2016).
Dra. Karelen Araujo, Dra. Ana Cáceres, Dra. María Berradre, MSc. Zulay Mármol, MSc. Johanna Raga, MSc. Marisela Rincón
4
La levadura autóctona Saccharomyces cerevisiae SCVMLUZ 2008 aislada del mosto en
fermentación espontánea de la variedad Malvasía de la cosecha del Centro de Desarrollo
Vitícola Socialista de Mara y la levadura comercial Hanseniaspora guilliermondii CECT
11102 actuaron como cepas parentales para generar una nueva levadura híbrida
(SCHLUZ2014) capaz no solo de terminar la fermentación consumiendo la mayoría de los
azúcares, sino también de formar etanol a concentraciones deseadas. Dicha cepa se empleó
como cultivo iniciador para llevar a cabo el proceso de fermentación del mosto y de esta forma
se obtuvo un vino con características propias y únicas de la Región Zuliana.
El objetivo principal de esta investigación fue obtener el perfil fisicoquímico de vino blanco
en términos de pH, acidez, grado alcohólico, concentración de azúcares, dióxido de azufre libre
y total producido mediante fermentación alcohólica por la cepa híbrida (SCHLUZ2014).
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Vinificaciones de mosto de uva
El mosto de uva de la Variedad Malvasía se obtuvo del Centro de Desarrollo Agrícola "El
Condado" ubicado en el Municipio Mara, estado Zulia, Venezuela.
Proceso de Fermentación
Se llevó a cabo de acuerdo al proceso corriente de vinificación en blanco a una temperatura
entre17-18°C, con adición de carbonato de etilo al inicio de la fermentación. Se realizaron
cuatro bioprocesos en botellones de 5L por duplicado con los siguientes inóculos: a) S.
cerevisiae SCMCVLUZ 2008, b) H. guilliermondii CECT 11102, c) levadura obtenida en la
fusión de protoplastos y d) mezcla de cultivos S. cerevisiae y H. guilliermondii (10% / 90%).
El proceso de elaboración de vino blanco se realizó con algunas modificaciones de acuerdo al
esquema planteado por Hidalgo, (2011).
Análisis físico-químicos
Acidez titulable: Se determinó como ácido tartárico de acuerdo a las Normas COVENIN 3287,
(1997), al inicio y al final de las vinificaciones.
Sólidos solubles: Se siguió el método que establece la Organización Internacional de la Viña
y el Vino OIV-MA-AS2-02 2009. Se empleó un refractómetro marca Vee Gee, (Alemania),
modelo BTX-1.
Densidad relativa: Se utilizó el método OIV-MA-AS2-01-A propuesto por la Organización
Internacional de la Viña y el Vino. Se comparó la densidad del mosto o vino respecto a la
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densidad del agua pura a una temperatura de 20°C, por lo que al dividir la masa de la muestra
dentro del picnómetro respecto de la masa correspondiente de agua, se obtuvo la densidad
relativa de la muestra.
Azúcares: Se empleó el método OIV-MA-AS311-03 indicado por la Organización
Internacional de la Viña y el Vino. Los azúcares fructosa y glucosa se midieron con un
cromatógrafo líquido de alta resolución (HPLC), marca Agilent Technologies (Palo Alto,
USA), modelo Serie 1100 (desgasificador G1379A y bomba cuaternaria G1311A). Se empleó
una columna Zorbax Carbohidratos (4.6 x 150 mm 5μm) a un caudal de 1,4 mL.min
-1
, modo
isocrático, y la fase móvil Acetonitrilo/Agua (85:15, v/v). Se trabajó a temperatura ambiente
(23 ºC) y a una presión de 45 bar. Se utilizó un volumen de inyección de 20 µL. Se analizaron
los azúcares mediante el detector de índice de refracción.
Los patrones y las muestras de mosto y vino se almacenaron bajo congelación a -20 ºC y se
filtraron con una membrana de Nylon (0,2 µm). Se desgasificaron con un baño de ultrasonidos
antes de su análisis por duplicado de cada réplica. Se optimizó la resolución de los azúcares
variando la relación de solventes y se procedió a validar el método en términos de sensibilidad
instrumental, precisión, estudio de interferencias químicas y exactitud (Quatrtrochi et al.,
1992). Se utilizaron patrones de alta pureza (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
pH: se utilizó el método propuesto la Organización Internacional de la Viña y el Vino OIV-
MA-BS-13, (2009), empleando un pHmetro (Oaklon, 35634-40, Singapore).
Etanol: se midió por cromatografía de gases aplicando el método propuesto por Rodríguez &
Suárez, (2007). Se utilizó un equipo marca Agilent Tecnologies (Palo Alto, USA) modelo
19091J-413, equipado con un detector de ionización a la llama (FID), un automuestrador 7673
y un sistema de inyección Split/Splitless. Se empleó helio como gas de arrastre y aire e
hidrógeno para la ignición de la llama del detector. Las separaciones se llevaron a cabo en una
columna empacada HP-5 (5% fenil metil siloxano) de 30 m de longitud, diámetro interno de
250 µm y 0,25 µm nominal.
El detector libre FID operó a una temperatura de 250°C mientras que el puerto de inyección se
mantuvo a 230°C. La temperatura del horno estuvo en 40°C isotérmico durante 1 minuto y
luego se incrementó a una rata de 10°C por minuto hasta 100°C. El etanol y metanol se
identificaron comparando su tiempo de retención con el de los patrones. La cuantificación se
llevó a cabo de acuerdo al método del estándar externo. El metanol se determinó solo en los
vinos como medida de control de calidad.
Dióxido de Azufre libre y total: Se empleó el método indicado por las Normas COVENIN
3284, (1997). Para la determinación de dióxido de azufre libre se adicionó almidón como
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6
indicador, ácido sulfúrico y unas trazas de bicarbonato sódico para expulsar el aire.
Rápidamente se valoró el ácido sulfuroso usando una solución de yodo 0,02N. Para el ensayo
de dióxido de azufre total se agregó NaOH 0,1N para conseguir la hidrólisis del acetaldehído-
ácido sulfuroso. Luego se siguió el procedimiento descrito para la obtención del dióxido de
azufre libre.
Acidez Volátil: Se determinó de acuerdo al método recomendado por las Normas COVENIN
3284, (1997). Consistió en una destilación previa de la fracción acética presente en el vino y
una posterior valoración con solución de NaOH.
2.2. Análisis estadístico
Los resultados obtenidos para la caracterización de los vinos, se analizaron según un análisis
de varianza de un solo factor. Este análisis permite contrastar la hipótesis nula de que las medias
de K poblaciones (K>2) son iguales, frente a la hipótesis alternativa de que por lo menos una
de las poblaciones difiere de las demás en cuanto a su valor agregado (Montogomery & Runger,
2005). Pruebas de comparaciones de media se llevaron a cabo con los test de Índice de Tukey.
Se fijó el nivel de significancia o nivel crítico en P≤0,05. Los datos se analizaron utilizando el
programa estadístico SPSS 20.0 para Windows (SPSS Inc., Chigago, IL).
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Validación analítica del método de determinación de azúcares
El método propuesto por la Organización Internacional del Vino OIV-MA-AS311-03, (2009),
establece para la fase móvil una relación 80:20 acetonitrilo agua. Sin embargo, bajo estas
condiciones no se obtuvo una buena resolución y el pico de glucosa presentaba una cola
importante. Se procedió a cambiar la relación de la fase móvil hasta encontrar una óptima para
la representación de picos definidos y con buena resolución. Siguiendo las recomendaciones
publicadas se evaluó el desempeño de la metodología analítica utilizada para la determinación
de fructosa y glucosa en mosto de uva.
Se seleccionó como método de calibración el patrón interno. Parar ello se prepararon curvas de
calibración independientes para los dos analitos de interés (glucosa y fructosa) en el intervalo
comprendido entre 0 y 20 mg ml
-1
(0, 1, 2, 4, 10 y 20 mg.mL
-1
), incorporando en todas las
disoluciones de trabajo (patrones y muestras) el estándar interno (maltosa) a una concentración
fija y constante de 10 mg
-1
. La selección de este azúcar como patrón interno se justifica ya que
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su naturaleza es similar a la de los azúcares que se estudian y, además, no se encuentra presente
en las muestras.
El cromatograma típico al inyectar el mismo volumen de los patrones que contienen el estándar
interno se muestra en la Figura 1. Una vez realizadas las diferentes lecturas de las señales
analíticas se procedió a graficar las curvas de calibración que contienen la relación de las áreas
de los picos de cada uno de los estándares con respecto al estándar interno en función de la
relación de las concentraciones, como se muestra en las Figuras 2 y 3. Se obtuvieron
coeficientes de correlación lineal de Pearson (r) superiores a 0,995. Se observó comportamiento
lineal hasta el estándar de mayor concentración utilizado en la calibración de ambas azúcares.
Figura 1. Cromatograma típico de una muestra de mosto de uva del día 0 de la fermentación. Flujo: 1,4
mL.min
-1
. Fase móvil: (85/15; ACN-H
2
O). P=46 bar. Columna Zorbax Carbohidratos (4.6 x 150 mm 5μm).
Volumen de inyección: 20 µL.
Figura 2. Curva de calibración de fructosa para fructosa.
Área de fructosa/Área de
maltosa
Concentración de fructosa/Concentración de maltosa
y=1,109x+0,005
R
2
=0,998
Fructosa
Glucosa
Maltosaa
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Figura 3. Curva de calibración de glucosa
En la Tabla 1 se observan los valores de límite de detección, de cuantificación y de sensibilidad
analítica.
Tabla 1. Límites de detección y cuantificación para fructosa y glucosa.
LOD
(mg.mL
-1
)
LOQ
(mg.mL
-1
)
Sensibilidad
instrumental
1,484
4,325
1,109
1,085
3,617
1,113
3.2. Precisión
El estudio de precisión se evaluó para cada azúcar, a través de la repetibilidad (las soluciones
se inyectaron en el mismo equipo por el mismo analista y el mismo día) y reproducibilidad (las
soluciones se inyectaron en el mismo equipo por otro analista en días distintos). En ambos
casos, se utilizó para su evaluación la desviación estándar relativa (DER, en %).
Las muestras de fructosa y glucosa del primer día de la fermentación con la especie S.
cerevisiae se inyectaron por pentaplicado (n=5). La Tabla 2 muestra que los valores de
repetibilidad para cada azúcar expresados como DER es menor al 5%. Sin embargo, para la
reproducibilidad se obtuvo una DER ente 5 y 6%. Internacionalmente, se considera adecuado
variaciones menores al 5%. No obstante, para concentraciones comprendidas entre 100 ppb y
1 ppm se aceptan DER entre 11 y 15% (AOAC, 2005), debido a que las concentraciones de
estudio son superiores, el criterio puede emplearse para este caso y de esta forma considerar
adecuados los valores obtenidos de precisión para los análisis de los azúcares realizados,
estableciendo de este modo que el método es preciso.
Tabla 2. Estudio de precisión para la determinación de fructosa y glucosa en muestras de mosto de uva en el
primer día de fermentación.
Repetibilidad
Reproducibilidad
Analito
(mg.mL
-1
)*
DER (%)
DER (%)
Fructosa
108,35
3,53
5,27
Glucosa
125,76
2,36
6,07
DER Desviación estándar relativa; * Muestras inyectadas por pentaplicado
Área de glucosa/Área de
maltosa
Concentración de glucosa/Concentración de maltosa
y=1,113x+0,007
R
2
=0,998
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3.3. Estudio de interferencias químicas
Se evaluaron las posibles interferencias químicas que pueden afectar el desempeño del método
de determinación de azúcares, comparando las pendientes de las curvas de calibración con
aquellas obtenidas por el método de adición estándar (Gary, 2010). Para la elaboración de las
curvas por el método de adición estándar se emplearon las concentraciones de: 5, 10 y 15 mg.L
-
1
para fructosa y glucosa, utilizando como blanco una muestra de mosto fermentado con la S.
cerevisiae en el día cuatro del proceso y leídas cinco veces. Al graficar el promedio de la
relación de áreas de los picos en función de la relación de las concentraciones se obtuvieron,
para ambas curvas, coeficientes de correlación lineal de Pearson r ≥ 0,995, tal como se observa
en la Figura 4.
Figura 4. Evaluación de las interferencias en la determinación de azúcares.
Se observa un paralelismo entre las pendientes de las curvas de calibrado y la de adición
estándar. El error que existe entre las pendientes de estas curvas es menor al 5 %, tal como se
aprecia en las ecuaciones de las rectas (curva de calibración glucosa: 1,113/ adición estándar:
y = 1,109x + 0,005
R² = 0,998
y = 1,056x + 0,310
R² = 0,998
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 0,5 1 1,5 2
Área de fructosa/Área de
maltosa
Concentración de fructosa/Concentración de maltosa
y = 1,113x + 0,007
R² = 0,998
y = 1,169x + 0,122
R² = 0,998
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 0,5 1 1,5 2
Área de glucosa/Área de
maltosa
Concentración de glucosa/Concentración de maltosa
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1,169; curva de calibración fructosa: 1,109/ adición estándar: 1,056). Estos resultados indican
que no existe en ninguno de los casos estudiados un efecto interferente por parte de la matriz
que pueda ser considerado como significativo. En consecuencia, se procedió a realizar la
cuantificación de los azúcares presentes en las muestras de mosto y vinos mediante el método
de calibración del patrón interno.
3.4. Exactitud
El estudio de recuperación se realizó a partir de los valores obtenidos al inyectar por
pentaplicado réplicas del mosto de uva del día cuatro de la fermentación realizada con el cultivo
puro S. cerevisiae. Las muestras se enriquecieron con patrones de fructosa y glucosa a tres
niveles de concentración (5, 10 y 15 mg.mL
-1
). La Tabla 3 presenta los porcentajes de
recuperación. Para las concentraciones de estudio, las recuperaciones deben oscilar entre 80 y
110% (AOAC, 2005), por lo tanto, se encuentran dentro de los valores propuestos por esta
organización. Para corroborar la aceptación de los porcentajes promedio obtenidos y de que no
existen diferencias estadísticamente significativas, se utilizó el 100% de recuperación como
criterio de aceptabilidad en la prueba t de student. Para un nivel de significancia de α= 0,01
con (n-1) grados de libertad y n=5, el valor de t
cri
(valor teórico de t) es 4,60. Los valores
calculados de t
r
se muestran en la Tabla 1. Al comparar los valores de t
r
con el valor t
cri
, se
observa que en todos los niveles de recuperaciones t
r
es menor a t
cri
, por lo tanto no existen
diferencias significativas entre los porcentajes de recuperación evaluados a un nivel de
confianza del 99%. De esta manera se concluye que los valores de recuperación pueden
aceptarse y el método se consideró exacto.
Tabla 3. Estudio de recuperación como evaluación de exactitud para la determinación simultánea de fructosa y
glucosa en mosto de uva.
Analito
Adición
(mg.mL
-1
)
Esperada
(mg.mL
-1
)
Encontrada
(mg.mL
-1
)
Recuperación
(%)
t
r
(n=5)
(α=0,01); (n-1))
5
38,762
38,303
90,82
0,52
Fructosa
10
43,762
43,039
92,77
0,31
15
48,762
46,634
87,81
1,67
5
15,690
15,170
96,28
0,26
Glucosa
10
20,690
20,814
101,24
0,12
15
25,690
23,734
86,96
1,18
3.5. Perfiles de Fermentación
Dado que se utilizaron diferentes levaduras en este estudio que pueden generar niveles
diferentes de metabolitos, se monitoreó durante la fermentación el consumo de los azúcares
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hexosas y la formación de etanol. Los perfiles de fermentación se muestran en las Figuras 5,
6, 7 y 8. Al comienzo de la fermentación el mosto sin fermentar contiene cantidades similares
de las dos hexosas: fructosa y glucosa. Se observa que ambos azúcares son fermentados por las
levaduras de estudio para la producción principalmente de etanol, sin embargo, éstas consumen
glucosa más rápido que fructosa, confirmando de este modo el carácter glucofílico de las
levaduras (Mocke, 2013). En todas las fermentaciones se consumieron en su totalidad los
azúcares presentes. S. cerevisiae consumió más rápidamente los azúcares (144 horas), en
comparación con el resto de las cepas (192 horas).
Figura 5. Consumo de azúcares y producción de etanol por S. cervisiae autóctona SCMCVLUZ 2008.
Figura 6. Consumo de azúcares y producción de etanol por H. guilliermondii CECT 11102.
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0 48 96 144 192 240 288
% Vol
Azúcar Residual (gL
-1
)
Tiempo (h)
Fructosa
Glucosa
Etanol
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0 48 96 144 192 240 288
% Vol
Azúcar Residual (gL
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)
Tiempo (h)
Fructosa
Glucos a
Etanol
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Figura 7. Consumo de azúcares y producción de etanol por la levadura obtenida de la fusión de protoplastos
(SCHLUZ2014).
Figura 8. Consumo de azúcares y producción de etanol por el cultivo mixto de S. cerevisiae y H. guilliermondii.
Para todos los casos se toma más tiempo para asimilar la fructosa disponible. Ambas hexosas
pueden ser consumidas al mismo tiempo por las levaduras, pero la preferencia de ésta por la
glucosa hace que los perfiles de consumo sean diferentes. En consecuencia, el azúcar residual
luego de haber culminado la fermentación contiene más fructosa que glucosa.
La fructosa es más dulce que la glucosa, por lo tanto, su presencia en el vino puede ocasionar
un indeseable dulzor (Berthels et al., 2004). Las levaduras alcohólicas prefieren metabolizar la
glucosa en lugar de la fructosa. Este mecanismo lo describió Zinnay et al., (2013). En este
estudio, se realizó un modelo matemático con parámetros físico-químicos, llegando a la
conclusión de que la acumulación de etanol en el medio de reacción justifica las diferencias
entre las velocidades de consumo de los dos azúcares involucrados en la fermentación
alcohólica.
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Azúcar Residual (gL
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)
Tiempo (h)
Fructosa
Glucosa
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DE LEVADURAS (SACCHAROMYCES CEREVISIAE Y HANSENIASPORA GUILLIERMONDII)
Publicación Cuatrimestral. Vol. 4, No 2, Mayo/Agosto, Año 2019, Ecuador (p. 1-20) 13
En las Figuras 5, 6, 7 y 8 el comportamiento de los azúcares durante las primeras horas es
similar, pero a medida que aumenta la concentración de etanol comienza la preferencia marcada
por la glucosa. De acuerdo a Mocke (2013), a bajas concentraciones de etanol, las velocidades
de conversión de la glucosa y fructosa no difieren significativamente. No obstante, cuando se
incrementa dicha concentración la velocidad de consumo de glucosa es mayor que la de
fructosa. Bajo estas condiciones, la transformación enzimática de la fructosa a etanol es más
sensible que la de la glucosa, afectando principalmente el transporte activo del azúcar a través
de la membrana celular. Las variaciones en las velocidades de fermentación pueden ser debidas
a alteraciones en el transporte de los azúcares o a diferencias en la fosforilación que ocurre
dentro de las células (Mocke, 2013).
La cinética de producción del fue más rápida para la fermentación llevada a cabo con S.
cerevisiae. Se realizó un análisis estadístico de medidas repetidas en el tiempo en un factor
para la glucosa y fructosa. Estas arrojaron que para ambos azúcares el tiempo es un factor
significativo, es decir; éstos van cambiando significativamente durante el transcurso de la
fermentación. También resultó significativo el efecto de los tratamientos, es decir; el consumo
de azúcares varía significativamente durante las vinificaciones de acuerdo a la levadura
empleada. Con los resultados de las pruebas de comparaciones de medias se puede concluir
que la levadura hibrida tiene un comportamiento distinto en relación al perfil de azucares con
respecto del resto de las cepas H. guilliermondii y el cultivo mixto pero no difiere
significativamente de la cinética desarrollada por S. cerevisiae.
La cinética de producción de etanol analizada también se analizó con el mismo modelo. Los
resultados indican que el tiempo y los tratamientos son significativos. Al estudiar los datos de
las diferencias de medias, se observa que lo niveles de etanol generados por la levadura S.
cerevisiae son significativamente superiores al resto de los tratamientos aplicados.
3.6. Caracterización fisicoquímica de los vinos elaborados
La densidad es uno de los parámetros medidos con el propósito de llevar un control de la
fermentación y también es uno de los factores que indica la culminación del proceso. En la
Tabla 4 se observan que todos los valores de densidad relativa de los vinos elaborados con las
levaduras de estudio presentan un valor igual a 0,99. Según Hidalgo, (2011) la vinificación
termina en la elaboración en blanco cuando se alcanzan densidades relativas alrededor de 0,99,
quedando el vino resultante con menos de 1 g.L
-1
de azúcares residuales (Hidalgo, 2011). De
acuerdo al criterio se evidenció que efectivamente culminó el proceso de fermentación. Los
Dra. Karelen Araujo, Dra. Ana Cáceres, Dra. María Berradre, MSc. Zulay Mármol, MSc. Johanna Raga, MSc. Marisela Rincón
14
resultados encontrados son similares a los reportados por Falguera et al., 2013 y Herrera &
Miño (2011) para las variedades Xarello e Isabella, respectivamente.
Tabla 4. Principales características enológicas de los vinos elaborados.
Parámetro
S. cerevisiae
H. guilliermondii
Híbrido
S. cerevisiae/
H. guilliermonii
Densidad relativa
pH
Acidez Titulable
(g acido tartárico.L
-1
)
Etanol (%v/v)
Rendimiento EtOH (%)
Glucosa (g.L
-1
)*
Fructosa (g.L
-1
)**
Acidez volátil
(g ácido acético.L
-1
)
Dióxido de azufre libre (g.L
-1
)
Dióxido de azufre
total (g.L
-1
)
0,99±0,00
a
3,48±0,02
a
6,55
a
±0,00
11,31±0,90
a
100,08
a
ND
ND
0,06
a
±0,000
0,03
a
±1,96
0,04
a
±1,26
0,99±0,00
a
3,53±0,00
a
6,78
b
±0,01
10,91±0,59
b
96,55
b
ND
ND
0,06
a
±0,000
0,03
a
±0,60
0,04
a
±1,24
0,99±0,00
a
3,50±0,02
a
6,85
c
±0,02
10,45±0,69
c
92,47
c
ND
ND
0,06
a
±0,000
0,03
a
±1,36
0,04
a
±0,53
0,99±0,00
a
3,41±0,02
a
7,30
d
±0,01
9,88±0,49
d
87,43
d
ND
ND
0,06a±0,000
0,02
a
±1,53
0,05
b
±0,75
a,b, c,d
Índices de Tukey (P<0,05). Letras diferentes evidencian diferencias significativas; ND: No detectable. Valores promedios de tres
mediciones; *LOD:1,08 g.L
-1
; **LOQ: 3,62 g.L
-1
; **LOD:1,30 g.L
-1
; **LOQ: 4,33 g.L
-1
El pH es importante por su efecto sobre los microorganismos, en relación a la resistencia a
enfermedades, color, sabor, potencial redox y sobre la producción de dióxido de azufre libre y
combinado. Los valores promedios de pH obtenidos en los vinos elaborados con las distintas
levaduras de estudio, se presentan en la Tabla 4. Estos varían entre 3,41 y 3,53 pero no hubo
diferencia significativa entre los valores de pH.
Según Amerine & Ough, (1976) los vinos de mesa deben tener un pH inferior a 3,6. Los valores
obtenidos se encuentran dentro de los rangos reportados por (Hidalgo, 2011 y Falguera et al.,
2013). Sin embargo, son ligeramente superiores a los reportados en los estudios de Fernández
et al., (2009) y García-Martín et al., (2010). El primero caracterizó vinos blancos comerciales
venezolanos, y los valores estuvieron alrededor de 3,25 y en el segundo se expusieron valores
entre 3,05 y 3,14 para los vinos blancos de la variedad Verdejo. La Norma Venezolana
(COVENIN, 1997) no toma en cuenta este parámetro.
Entre los principales ácidos presentes en el vino, el más fuerte es el ácido tartárico. Es el
primero en convertirse en sal de potasio, por tal razón la acidez titulable se expresa como ácido
tartárico. En la Tabla 4 se aprecia los valores promedios difieren significativamente entre sí,
sin embargo, se encuentran dentro de lo reportado por la Norma Venezolana (COVENIN,
1997) que establece que tengan una acidez titulable mayor a 4 g.L
-1
.
Los valores encontrados son ligeramente inferiores a los obtenidos por García-Martín (2010)
que reportaron valores de acidez titulable entre 7,42 y 8,17 4 g.L
-1
para vinos blancos de la
variedad Verdejo. Por su parte, Fernández et al., (2009) reportaron valores bajos de acidez
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titulable para los vinos venezolanos (4 g ácido tartárico.L
-1
), establecido por la Norma
venezolana COVENIN.
La acidez titulable en los vinos es superior a la de los mostos. Esto se atribuye a que durante la
vinificación aparecen ácidos procedentes del metabolismo de las levaduras, principalmente
ácido succínico y en menores proporciones ácido láctico y acético (Bernardi, 2013).
De acuerdo a Moreno & Peinado (2009), el contenido de ácido tartárico disminuye durante la
vinificación a medida que el contenido de etanol aumenta. Esta relación explica la razón por la
que con S. cerevisiae se obtiene el vino de mayor grado alcohólico (11,30 %v/v) y a la vez con
menor acidez titulable, 6,55 g ácido tartárico.L
-1
, la tendencia se impone para el resto de los
vinos y de esta manera el preparado con el cultivo mixto S. cerevisiae/H. guilliermondii
presentó la mayor acidez titulable, 7,30 g ácido tartárico.L
-1
, y por ende el menor grado
alcohólico (9,88 %v/v).
La aparición de etanol durante la fermentación alcohólica produce una disminución de las sales
del ácido tartárico, principalmente tartrato de potásico y tartrato de calcio, que precipitan en el
fondo del recipiente debido a que con el alcohol disminuye la solubilidad de la sal. A pesar de
las precipitaciones se mantiene una sobresaturación de estas dos sales, es decir; en solución
hay cantidades superiores a las que se esperaría de acuerdo a su solubilidad. Esto hace que el
vino sea sensible a la aparición de turbideces cuando disminuye la temperatura (Moreno &
Peinado, 2009).
La concentración de alcohol obtenida en los vinos elaborados con las diferentes levaduras
difiere significativamente entre sí y se encuentran dentro del rango indicado por COVENIN
3342, (1997) (7-14 %v/v) para vinos de uva. S. cerevisiae produjo mayor cantidad de alcohol
(11,30%v/v) con respecto al resto de las levaduras estudiadas. Es importante destacar que la
cepa resultante de la fusión de protoplastos fue mayor productora de etanol (10,45%v/v) que
el cultivo de S. cerevisiae/H. guilliermondii. (9,88%v/v) y su valor es comparable con los
reportados por García-Martín et al., 2010 y con los expuestos en el trabajo de Sener et al.,
(2007) para vinos blancos de la variedad Emir, los cuales estuvieron entre 10,13 y 11,40% v/v
empleando diferentes tipos de levaduras comerciales S. cerevisiae.
Los grados alcohólicos obtenidos estuvieron por debajo de los expresados por Fernández et al.,
(2009) y por Ciani et al., (2006), los cuales fueron 12,26 %v/v y en el otro estudio oscilaron
entre 13,6 y 15,9% utilizando mosto sintético y cultivos puros de S.cerevisiae y mixtos de S.
cerevisiae, H. uvarum, Kluyveromyces thermotolerans y Torulaspora delbrueckii. Sin
embargo, los valores encontrados en esta investigación superaron al contenido de alcohol
reportado para el vino elaborado con H. uvarum en el trabajo realizado por Ciani et al., 2006.
Dra. Karelen Araujo, Dra. Ana Cáceres, Dra. María Berradre, MSc. Zulay Mármol, MSc. Johanna Raga, MSc. Marisela Rincón
16
La cantidad final de etanol es función del contenido de azúcares del mosto y de la capacidad
fermentativa de las levaduras. Dado que se utilizó el mismo mosto para todos los bioprocesos,
se considera que los resultados obtenidos se deben específicamente a la levadura utilizada. A
nivel comercial éste parámetro es de gran importancia ya que los vinos y otras bebidas
alcohólicas se comercializan y cotizan según su grado alcohólico (Carazola & Xirau, 2005).
En la práctica, una fermentación se considera correcta cuando por cada 17 gramos de azúcar,
aproximadamente, se consigue un grado de alcohol (1%v/v) (Moreno y Peinado, 2009).
Partiendo de esta premisa fue posible calcular el grado alcohólico teórico a partir de la
concentración inicial de azúcares y de esta forma obtener el rendimiento de etanol, tal como se
aprecia en la Tabla 4. Este parámetro, como era de esperarse, se comportó igual que el grado
alcohólico.
Todos los vinos presentaron valores de rendimiento en etanol que difieren significativamente
entre sí. El mayor porcentaje se obtuvo en el vino elaborado con S. cerevisiae (100,08%). El
vino fermentado con la levadura híbrida producto de la fusión de protoplastos presentó un
rendimiento igual a (93,55% v/v) y superior al cultivo mixto de S. cerevisiae y H.
guilliermondii (87,43 % v/v). Estos resultados se consideran aceptables debido a que se
encuentran próximos al 100%, a excepción del rendimiento obtenido para el vino realizado con
el cultivo mixto.
Los valores de rendimiento son inferiores a los reportados por García-Martín et al., (2010), los
cuales varían entre 88,45 y 186,8%. Los altos contenidos de azúcar, así como los altos
rendimiento son una de los aspectos que preocupan a la industria vitícola actualmente. De
acuerdo con González et al., (2007) las especies de S. cerevisiae se han adaptado a lo largo de
su evolución para optimizar su crecimiento en ambientes ricos en azúcares y aminoácidos y de
esta forma ser capaces de metabolizar la glucosa y fructosa por vía respirativa, fermentativa y
de crecer en condiciones aerobias y anaerobias.
La determinación de glucosa y fructosa es fundamental en vinos ya que altos contenidos de
azúcares residuales son susceptibles a la contaminación microbiana y son inaceptables para el
mercado por el dulzor del vino. Excesiva cantidad de fructosa puede comprometer la calidad
del producto debido a que la fructosa es dos veces más dulce que la glucosa y le añade un sabor
indeseado. Esto puede ser ocasionado por paradas de fermentación o fermentaciones muy
lentas.
En la Tabla 4 también se observa que el contenido de glucosa y fructosa en los vinos de estudio
no pudo ser detectado con el método cromatográfico desarrollado. Los valores de estos
azúcares estuvieron por debajo de los límites de detección calculados para la glucosa y fructosa,
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DE LEVADURAS (SACCHAROMYCES CEREVISIAE Y HANSENIASPORA GUILLIERMONDII)
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los cuales fueron 1,08 y 1,3 g.L
-1,
respectivamente. Una fermentación completa se logra solo si
se alcanzan niveles de azúcares por debajo de 4 g.L
-1
, con concentraciones típicas promedios
de 2 g.L
-1
. (Mocke, 2013).
La cantidad de azúcares residuales en los vinos preparados se encontraron son similares a los
presentados por Ciani et al., (2006) y estuvieron por debajo de los reportados en el trabajo de
García-Martín et al., (2010), los cuales oscilaron entre 1,64 y 2,12 g.L
-1
. Todos los vinos
obtenidos según el contenido de azúcar se clasifican como "secos" por presentar contenidos de
azúcares inferiores a los 5 g.L
-1
(Moreno & Peinado, 2009).
La acidez volátil corresponde esencialmente a ácidos grasos de la serie acética. Debido a que
dichos ácidos son de bajo punto de ebullición, los hace fácilmente destilables (Vilela-Moura et
al., 2010). Este análisis es muy importante para la calidad del vino, debido a que permite
apreciar el grado de conservación y si ha sufrido alguna alteración (Cazarola & Xirau, 2005).
Los resultados obtenidos (0,06 g ácido acético.L
-1
) mostrados en la Tabla 4 fueron iguales para
los vinos fermentados con las distintas levaduras y estuvieron dentro de los límites establecidos
por COVENIN 3342 (1997), cuyo valor de referencia es una concentración menor a 1,0 g.L
-1
.
Los valores encontrados resultaron inferiores a los reportados por García-Martín et al., (2010)
y Ciani et al., (2006), los cuales estuvieron entre 1,64-2,12 g.L
-1
y 0,13-0,35 g.L
-1
,
respectivamente.
En otro orden de ideas, tradicionalmente el dióxido de azufre se utiliza para controlar el
crecimiento de microorganismos indeseados y la actividad de la polifenoloxidasa durante la
vinificación. Esta enzima es la principal responsable de la oxidación del vino (Oliveira et al.,
2011). La industria vitícola desde hace poco tiempo se encuentra preocupada por reducir los
niveles de dióxido de azufre debido a que este compuesto es considerado por sus efectos sobre
la fisiología de los seres humanos como una sustancia ligeramente tóxica (Hidalgo, 2011). De
allí radica la importancia de la medición de este parámetro.
Éste compuesto cuando es incorporado a los vinos se encuentra como anhídrido sulfuroso
gaseoso, sulfito o bisulfito. Este último reacciona con el acetaldehído para formar el
acetaldehído-α-hidroxi sulfonato, además reacciona con la glucosa, con el ácido pirúvico, α-
cetoglutárico y galacturónico y con compuestos fenólicos como el p-cumárico. Todo el dióxido
de azufre que reacciona de este modo se llama dióxido de azufre combinado, mientas que el
resto es el dióxido de azufre libre
El dióxido de azufre libre es la fracción activa que posee la mayor parte de las propiedades
antisépticas y antioxidantes. En la Tabla 4 se presentan los resultados obtenidos y se observa
que existe diferencia significativa entre los valores reportados para el dióxido de azufre libre y
Dra. Karelen Araujo, Dra. Ana Cáceres, Dra. María Berradre, MSc. Zulay Mármol, MSc. Johanna Raga, MSc. Marisela Rincón
18
entre los resultados expresados para el dióxido de azufre total. La concentración de dióxido de
azufre total en todos los casos estudiados (0,04 g.L
-1
para los vinos elaborados con S.
cerevisiae, H. guilliermondii, híbridos y 0,05 g.L
-1
para el cultivo mixto), estuvieron por debajo
de los límites legales establecidos por parte de la Norma Venezolana COVENIN, 3342:1997 y
del Reglamento de la Unión Europea nº 606/2009, los cuales son 0,25 y 0,2 g.L
-1
respectivamente. Los resultados son similares a los expuestos por Fernández et al., (2009) para
el dióxido de azufre total pero son ligeramente superiores en el caso del dióxido de azufre libre
(0,02 .g.L
-1
).
4. CONCLUSIONES
El perfil obtenido del vino elaborado con la levadura producto de la fusión de protoplastos,
entre los que se incluyen los análisis de pH, acidez, grado alcohólico, concentración de
azúcares, dióxido de azufre libre y total refleja que se encuentran dentro de los parámetros
establecidos por las normas nacionales e internacionales. Durante las vinificaciones las
levaduras S. cerevisiae, H. guilliermondii, la levadura híbrida y el cultivo mixto de S.
cerevisiae/H. guilliermondii, consumieron glucosa más rápidamente que fructosa lo que indica
el carácter glucofílico de las levaduras. La cinética de consumo de los azúcares fue más rápida
en los bioprocesos realizados con S. cerevisiae y la levadura producto de la fusión de
protoplastos. La cinética de producción de etanol también fue más rápida con la cepa autóctona
S. cerevisiae.
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