INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE Salmonella spp y Staphylococcus aureus POR EFECTO DEL ACEITE ESENCIAL DE ORÉGANO EN
UNA PELÍCULA BIODEGRADABLE ACTIVA DE ÁCIDO POLILÁCTICO
Publicación Cuatrimestral. Vol. 5, No 1, Enero/Abril, Año 2020, Ecuador (p. 41-50) 41
Publicación Cuatrimestral. Vol. 5, No 1, Enero/Abril, 2020, Ecuador (p. 41-50). Edición continua.
INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE Salmonella spp y Staphylococcus aureus POR
EFECTO DEL ACEITE ESENCIAL DE ORÉGANO EN UNA PELÍCULA
BIODEGRADABLE ACTIVA DE ÁCIDO POLILÁCTICO
Anderson Pazmiño Castro
1*
, Ana Campuzano Vera
2
, Karina Marín Morocho
2
1
Instituto de Ciencias Básicas, Universidad Técnica de Manabí, Av. José María Urbina y Che Guevara, Portoviejo,
Ecuador. E-mail: apazmino@utm.edu.ec
2
Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Agraria del Ecuador, Av. 25 de Julio y Pio Jaramillo, Guayaquil, Ecuador.
E-mail: acampuzano@uagraria.edu.ec, kmarin@uagraria.edu.ec.
*Autor para la correspondencia: apazmino@utm.edu.ec
Recibido: 02-10-2019 / Aceptado: 14-4-2020 / Publicación: 30-04-2020
Editor Académico: María del Rosario Brunetto
RESUMEN
Con la finalidad de reducir el número de personas afectadas por enfermedades transmitidas por alimentos,se elaboraron
películas biodegradables activas con propiedades antibacterianas a partir de ácido poliláctico, polietilenglicol, y aceite
esencial de orégano (Origanum vulgare) al 1% (p/p) y 2 % (p/p). Las películas biodegradables activas fueron elaboradas
mediante el método de evaporación del solvente. Se evaluó la acción antibacteriana de las películas biodegradables activas
mediante un ensayo de inhibición a la adhesión microbiana contra Salmonella spp. y Staphylococcus aureus. Se pudo
establecer que los porcentajes de aceite esencial aplicados tienen poco efecto inhibitorio sobre Staphylococcus aureus,
mientras que para Salmonella spp. hay un efecto directo sobre la inhibición, cuando la concentración de aceite esencial
es del 2% (p/p). Para una concentración del 1% (p/p), el efecto inhibidor observado fue pobre. Los resultados indican que
las bacterias Gram-negativas Salmonella spp son más susceptibles al daño en la pared celular provocado por el aceite
esencial de orégano, debido al menor espesor de la misma. En contraste, el mayor grosor de la pared celular que presentan
las bacterias Gram-positivas Staphylococcus aureus exige, en principio, de un tiempo mayor para poder producir la lisis
celular. Las películas biodegradables activas con aceite esencial de orégano pueden emplearse para la conservación de
los alimentos como una tecnología de barrera en conjunto con otros mecanismos de control microbiano y así minimizar
tratamientos térmicos severos o reducir la utilización de aditivos alimentarios, que en concentraciones inadecuadas pueden
producir cierta toxicidad.
Palabras clave: películas biodegradables activas, contaminación de alimentos, inhibición bacteriana.
INHIBITION OF Salmonella spp y Staphylococcus aureus GROWTH BY Origanum vulgare
ESSENTIAL OIL IN A POLYLACTIC ACID BIODEGRADABLE FILM
ABSTRACT
In order to reduce the number of people affected by foodborne illnesses, active biodegradable films with antibacterial
properties were made with polylactic acid, polyethylene glycol, and essential oil of oregano (Origanum vulgare) at 1%
(w/w) and 2% (w/w). The active biodegradable films were made using solvent evaporation method. The active
biodegradable films antibacterial action was evaluated by microbial adhesion inhibition test against Salmonella spp. and
Staphylococcus aureus. It was established that the percentages of essential oil used have little inhibitory effect on
Staphylococcus aureus, while for Salmonella spp. there is a direct effect on inhibition, when the essential oil concentration
is 2% (w/w). For a concentration of 1% (w/w), the observed inhibitory effect was poor. The results indicate that Gram-
negative bacterias Salmonella spp are more susceptible to cellular wall damage caused by oregano essential oil, due to its
lower thickness. In contrast, the greater thickness of the cell wall that Staphylococcus aureus, Gram-positive bacteria has,
requires, in principle, a longer time to produce cell lysis. Biodegradable active films with oregano essential oil can be
Artículo de
Investigación
Ciencias Químicas
Anderson Pazmiño Castro, Ana Campuzano Vera, Karina Marín Morocho
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used for food preservation as a barrier technology in conjunction with other microbial control mechanisms, thus
minimizing severe heat treatments or reducing the use of food additives that, in inadequate concentrations can produce
some toxicity.
Keywords: active biodegradable films, food pathogens, bacterial inhibition.
EFEITO DE INIBIÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DE ORÉGANO EM UM FILME ATIVO
BIODEGRADÁVEL DE ÁCIDO POLILÁTICO
RESUMO
Para reduzir o número de pessoas afetadas por doenças transmitidas por alimentos, filmes biodegradáveis ativos com
propriedades antibacterianas foram feitos de ácido polilático, polietilenoglicol e óleo essencial de orégano (Origanum
vulgare) com 1% (p/p) e 2% (p/p). Os filmes biodegradáveis ativos foram feitos usando o método de evaporação do
solvente. A ação antibacteriana dos filmes biodegradáveis ativos foi avaliada por meio de um teste de inibição da adesão
microbiana contra Salmonella spp. e Staphylococcus aureus. Foi estabelecido que as porcentagens de óleo essencial
aplicado exercem pouco efeito inibitório sobre Staphylococcus aureus, enquanto Salmonella spp. há um efeito direto na
inibição, quando a concentração do óleo essencial é de 2% (p/p). Para uma concentração de 1% (p/p), o efeito inibitório
observado foi baixo. Os resultados indicam que as bactérias Gram-negativas são mais suscetíveis a danos na membrana
causados pelo óleo essencial de orégano, devido à sua menor espessura. Por outro lado, a maior espessura da parede
celular apresentada pelas bactérias altamente positivas requer, em princípio, mais tempo para produzir a lise celular.
Filmes ativos biodegradáveis com óleo essencial de orégano podem ser usados para preservação de alimentos como uma
tecnologia de barreira em conjunto com outros mecanismos de controle microbiano, minimizando tratamentos térmicos
severos ou reduzindo o uso de aditivos alimentares, que em concentrações inadequadas podem produzir alguma
toxicidade.
Palavras-chave: biopolímero; comida; inibição bacteriana; patógenos
Citación sugerida: Pazmiño, A., Campuzano, A., Marín, K. (2020). Inhibición del crecimiento de Salmonella spp y
Staphylococcus aureus por efecto del aceite esencial de orégano en una película biodegradable activa de ácido poliláctico
Revista Bases de la Ciencia, 5(1), 41-50. DOI: 10.33936/rev_bas_de_la_ciencia.v5i1.2035 Recuperado de:
https://revistas.utm.edu.ec/index.php/Basedelaciencia/article/view/2035
Orcid IDs:
MSc. Anderson Pazmiño Castro: https://orcid.org/0000-0002-0706-7692
MSc. Ana Campuzano Vera: https://orcid.org/0000-0003-0010-4267
MSc. Karina Marín Morocho: https://orcid.org/0000-0001-5333-3819
Dra. María del Rosario Brunetto: https://orcid.org/0000-0003-3848-5130
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1. INTRODUCCIÓN
El ácido poliláctico (PLA) es un biopolímero semicristalino obtenido de recursos renovables, como
el maíz y el azúcar, tras un proceso de polimerización controlada de ácido láctico. Sus características
de transparencia, inocuidad y biodegradabilidad lo hacen un polímero idóneo para el envasado
alimentario y para reducir el uso de poliolefinas (Blanot, 2014; Burgos Martino, y Jiménez, 2013;
Ruellan, Guinault, Sollogoub, Ducruet y Domenek, 2015).
La industria de alimentos y la academia dentro de este campo, además de intentar reducir el uso de
polímeros de lenta degradación, deben sumar mecanismos que permitan reducir el número de
personas que padecen de enfermedades transmitidas por alimentos y con ello también disminuir el
impacto socioeconómico que estas enfermedades suscitan (Jahid y Ha, 2012; Jorquera, Galarce y
Borie, 2015; Tauxe, Doyle, Kuchenmüller, Schlundt y Stein, 2010). A nivel mundial, se estima que
las enfermedades de transmisión alimentaria afectan a uno de cada diez personas, ocasionan 420000
muertes al año. Esta estimación mundial involucra a 31 agentes alimentarios causantes de 32
enfermedades: 11 agentes etiológicos de enfermedades diarreicas (1 virus, 7 bacterias y 3 protozoos),
7 de enfermedades infecciosas invasivas (1 virus, 5 bacterias y 1 protozoo), 10 helmintos y 3
productos químicos. Las enfermedades diarreicas representan el 95% de la enfermedades de
transmisión alimentaria en la región, siendo los principales agentes etiológicos, Norovirus, E. coli,
Campylobacter, y Salmonella no tifoidea (WHO, 2015).
Los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades estiman que sólo en los Estados Unidos,
48 millones de personas son afectadas por enfermedades transmitidas por alimentos (CDC, 2018).
Del total de esta estimación, el 20% se enferman a causa de 31 patógenos conocidos transmitidos por
los alimentos, y 80% son afectados por agentes no especificados que están en los alimentos pero que
no han sido verificados. Los patógenos que causan la mayoría de las enfermedades son, el norovirus
(58%), Salmonella spp. (11%), C. perfringens (10%), Campylobacter spp. (9%), y Staphylococcus
aureus (3%). A pesar de que los virus son los principales patógenos, el 64% de las hospitalizaciones
estimadas, son causadas por bacterias, de las cuales el 35% de ellas son por Salmonella spp. y 15%
por Campylobacter spp. De igual manera, el 64% de las muertes estimadas son causadas por bacterias,
provocadas principalmente por Salmonella spp. (28%) y Listeria monocytogenes (19%) (Scallan et
al., 2011).
La aplicación de aceites esenciales puede mejorar las propiedades antimicrobianas de los empaques,
y así sumar esfuerzos ante el desafío de reducir la contaminación de los alimentos con bacterias
patógenas (Lv, Liang, Yuan, y Li, 2011; Sung et al., 2013). El efecto antimicrobiano de diferentes
aceites esenciales contra patógenos que producen enfermedades alimentarias ha sido reportado (Calo,
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Crandall, O’Bryan, y Ricke, 2015; Franz y Novak, 2009), incluido entre ellos el aceite de orégano
(Origanum vulgare), que es ampliamente utilizado en la industria alimentaria, por ser reconocido
como seguro por la FDA y por su alto poder antioxidante y antimicrobiano, que tiene efecto en la
preservación de la calidad química, sensorial, nutricional y microbiológica de los alimentos (Asensio,
2013; Patiño, Moreno, y Chaparro, 2012; Ventura, Millones, Auquiñivin, Vásque, y Tafur, 2011).
El aceite esencial de orégano puro tiene diferentes proporciones de carvacrol, timol, 1,8-cineol, p-
cimeno y otros, que varían en concentración dependiendo de la especie, edad fisiológica de la planta,
ubicación geográfica y condiciones ambientales en las que se encuentra (Albado Plaus, Saez Flores,
y Grabiel Ataucusi, 2001; Asensio, 2013; Franz y Novak, 2009; Ventura et al., 2011). La actividad
antimicrobiana de este aceite esencial ha sido atribuida a sus compuestos terpenoides y partículas
fenólicas volátiles, principalmente carvacrol y timol, que provocan daño en la membrana
citoplasmática de los microorganismos, causando la muerte celular (Calo et al., 2015; Rhayour,
Bouchikhi, Tantaoui-Elaraki, Sendide, y Remmal, 2003; Sung et al., 2013).
Con la finalidad de evitar la contaminación bacteriana de alimentos frescos o mínimamente
procesados, y con ello reducir el número de personas que son afectadas por enfermedades transmitidas
por alimentos, el objetivo de este estudio es desarrollar un envase biodegradable activo con
propiedades antibacterianas a base de PLA y aceite esencial de orégano (Origanum vulgare), con
posible uso potencial para la industria de los alimentos, tomando como modelo para su evaluación a
los microorganismos patógenos Salmonella spp. y Staphylococcus aureus que se encuentran entre los
cinco principales microorganismos que contribuyen al contagio de enfermedades transmitidas por
alimentos (CDC, 2018).
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Ácido poliláctico (PLA-Ingeo
TM
Biopolymer 2003D) fue adquirido en forma de pellets de Nature
Works® Co. LLC (Estados Unidos). El plastificante polietilenglicol (PEG400) y el solvente
cloroformo fueron adquiridos de Loba Chemie Pvt. Ltd (India).
El aceite esencial de orégano (Origanum vulgare) fue adquirido en Nowfoods (Estados Unidos),
100% puro, con un contenido mínimo de 55% de carvacrol, derivado de la región del Mediterráneo
oriental, obtenido por arrastre de vapor.
Lo medios de cultivos y reactivos para las pruebas microbiológicas fueron comprados en Difco
(Estados Unidos). Las bacterias patógenas Staphylococcus aureus y Samonella spp. utilizadas en esta
investigación, fueron aisladas y cultivadas por el Centro de Investigaciones Biotecnológicas del
Ecuador (CIBE, Ecuador).
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2.1. Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de orégano
Para determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) del aceite esencial de orégano, se
procedió de acuerdo a la metodología descrita por Haba et al. (2014) con ligeras modificaciones.
Brevemente, la CMI fue determinada mediante ensayo de microdilución en caldo nutritivo y
suplementado con agar nutritivo al 0,15% (p/v). Se adicionaron 50 L de este caldo que se
distribuyeron desde el segundo hasta el doceavo pocillo en cada fila de una placa de microtitulación
de polipropileno (HDM Cia. Ltda, Ecuador) de 96 pocillos.
Una dilución de aceite esencial de orégano al 4% fue preparada, y de esta dilución se vertieron 100
µL al primer pocillo de cada fila de la placa de microtitulación; y luego 50 µL en dilución escalar
fueron transferidos desde el segundo al onceavo pocillo. Al pocillo 12 no se le agregó el aceite
esencial y se lo consideró como control de crecimiento. Posteriormente, a cada pocillo, exceptuando
al pocillo 11 de cada fila que sirvió como blanco, se le agregaron 50 µL de una suspensión microbiana
con una concentración aproximada de 10
5
-10
6
UFC/mL. El ensayo se hizo por cuadruplicado, de tal
manera que 4 filas de la placa fueron llenadas con Salmonella spp. y 4 filas con Staphylococcus
aureus. De esta forma, la concentración final del aceite esencial en el primer pocillo fue de 2% (v/v)
y en el undécimo pocillo de 0,00196% (v/v). Las placas se incubaron a 37°C durante 18 h.
2.2. Elaboración de películas biodegradables activas
Las películas biodegradables activas fueron preparadas a través de la modificación del método de
evaporación del solvente descrito por Concilio et al. (2015), en el cual 0,45 g de PLA fueron
mezclados con 0,045 g (10% con respecto al PLA) de PEG400. La mezcla fue disuelta en 20 mL de
cloroformo a temperatura ambiente hasta que el PLA se disuelva, con agitación continua a 250 rpm
y agregando la cantidad suficiente de cloroformo para mantener el volumen. El aceite esencial de
orégano en concentraciones de 1% (p/p) y 2% (p/p) con respecto al PLA, fue añadido a la solución
de cloroformo y PLA/PEG400, con agitación hasta que el aceite estuviera disuelto. A continuación,
la solución fue vertida en cajas Petri, agregando 5±0,5 g de solución en cada una de ella, y finalmente
se dejó durante 24 h a temperatura ambiente dentro de la cámara de extracción para que el solvente
se evapore. El espesor final de las películas fue medido en un micrómetro (Qualitest, USA).
2.3. Ensayo de anti-adherencia en superficie de la película activa con aceite esencial de orégano
El efecto de adherencia de los microorganismos sobre la película activa con aceite esencial de orégano
fue realizada modificando el método aplicado por Coronel-León, Marqués, Bastida, y Manresa
(2015). En resumen, las películas activas recibieron un pretratamiento de esterilización con luz UV
durante 24 horas. De allí, una película activa fue inoculada con Salmonella spp. ha una concentración
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de 10
4
UFC/mL y se dejó incubar a temperatura ambiente por 24 horas. Igual procedimiento se realizó
con otra película activa, pero con inoculación de Staphylococcus aureus. Este procedimiento se
realizó por duplicado para cada microorganismo y concentración de aceite esencial de orégano. Como
control se tuvo una película activa a la cual no se inocularon microorganismos, tan solo caldo
nutritivo. Después del tiempo de incubación, las películas activas fueron lavadas dos veces con 1 mL
de agua destilada, y luego las bacterias adheridas fueron fijadas con 1 mL de etanol. Se colocaron en
la estufa a 80°C hasta evaporar el etanol, y de allí se tiñeron con 200 µL de cristal violeta.
Posteriormente, las películas activas fueron lavadas con abundante agua. Las películas activas teñidas
fueron comparadas con el control, para establecer cualitativamente el efecto de inhibición sobre los
dos microorganismos evaluados.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Concentración mínima inhibitoria (CMI) del aceite esencial de orégano
La CMI alcanzada con el aceite de orégano para Salmonella spp. es de 0,016% (v/v) y para
Staphylococcus aureu de 0,031% (v/v). Estos resultados demuestran la actividad antimicrobiana del
aceite esencial de orégano, que es desarrollada fundamentalmente por sus principios activos,
carvacrol y timol, que provocan la lisis bacteriana (Calo et al., 2015; Lambert et al., 2001; Rhayour
et al., 2003).
La CMI para Salmonella spp. es menor a la CMI reportada por Pesavento et al., (2015) para
Salmonella enteritidis (0,25% - 0,125 %, v/v), y la CMI reportada por Oussalah, Caillet, Saucier, y
Lacroix (2007) para Salmonella typhimurium (0,05 %, v/v).
La CMI para Staphylococcus aureus se encuentra dentro del rango de CMI reportado por Nostro et
al. (2007) para varias cepas de este microorganismo; los cuales estuvieron entre 0,015-0,062 % (v/v).
Sin embargo, la CMI para Staphylococcus aureus es baja frente al valor de CMI de 2% reportado
por Carhuallanqui, Salazar, y Ramos (2020), en donde el resultado fue atribuido a una baja
concentración de carvacrol y timol.
Las diferencias encontradas pueden deberse principalmente al método empleado para encontrar la
CMI, y también a las características inherentes al aceite esencial empleado, que involucra la variedad,
edad fisiológica, zona geográfica y periodo de cosecha de la planta utilizada (Asensio, 2013; Burt,
2004; Franz y Novak, 2009; Ventura et al., 2011).
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3.2. Elaboración de películas biodegradables activas
Las películas activas elaboradas por el método evaporación del solvente fueron transparentes, con un
espesor promedio de 30±5 µm y con un diámetro aproximado de 9 cm.
Se logró obtener una película activa en donde se pudo observar una buena solubilidad de los
componentes con el polímero. La compatibilidad del aceite esencial de orégano con la matriz
polimérica fue notable, y está acorde con lo expuesto por Sung et al. (2013), en donde la utilización
de este aceite esencial en cantidades razonables no interrumpe la fase cristalina y la interacción
intermolecular de las cadenas de polímeros, impregnándose adecuadamente entre ellas porque el
tamaño de las partículas que lo componen así lo permite; y por ende no afecta notablemente las
propiedades físicas y mecánicas, y la estabilidad térmica de los polímeros.
3.3. Ensayo de anti-adherencia en la superficie de la película activa con aceite esencial de
orégano
Los resultados de comparación de la tinción de las películas activas con el control (Figura 1),
permiten determinar que los porcentajes de aceite esencial aplicados tienen poco efecto inhibitorio
sobre Staphylococcus aureus, mientras que para Salmonella spp., la mayor concentración de aceite
(2% p/p) tuvo un buen efecto de inhibición y un menor efecto en la concentración más baja (1% p/p).
Figura 1. Comparación de inhibición a la adhesión de Salmonella spp. y Staphylococcus aureus en las películas
biodegradables activas de PLA con 1% (p/p) y 2% (p/p) de aceite esencial de orégano.
Los resultados de inhibición obtenidos en el presente trabajo son similares al estudio realizado por
Patiño et al. (2012), donde concentraciones de 1% y 2% (p/p) de aceite esencial de orégano en películas
comestibles de pectina sobre lechuga mínimamente procesada evidencia una gran inhibición de
bacterias entre ellas Salmonella spp. y Escherichia coli.
Los resultados obtenidos potencian la aplicación del aceite esencial de orégano en polímeros
biodegradables como el PLA, logrando una película en donde las propiedades antibacterianas del
Control
Staphylococcus
aureus
Salmonella spp
Aceite esencial de
orégano al 1% (p/p)
Aceite esencial de
orégano al 2% (p/p)
Staphylococcus
aureus
Salmonella spp
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aceite esencial pueden ser aprovechadas para impedir que patógenos usen a los alimentos como
vehículos para causar enfermedades a las personas que los ingieren.
Tomando en cuenta la CMI obtenida en este trabajo de investigación para los microorganismos
probados y los porcentajes de aceites aplicados, es posible considerar que una proporción del aceite
esencial está siendo empaquetado en la matriz, condición que no permite una rápida liberación del
aceite sobre la superficie, retardando por esta vía el efecto sobre las bacterias que ofrezcan
mecanismos de resistencia o aquellas con un capa más gruesa de peptidoglicano, como en el caso de
Staphylococcus aureus.
4. CONCLUSIONES
Se logró obtener películas biodegradables activas que pueden ayudar a reducir la incidencia de
enfermedades transmitidas por alimentos. Se pudo agregar satisfactoriamente el aceite esencial de
orégano en la matriz polimérica en concentraciones de 1% (p/p) y 2% (p/p). En el caso de la
Salmonella spp el uso del aceite de orégano a la concentración del 2% (p/p) fue exitosa. Sin embargo,
para la Staphylococcus aureus los resultados observados no fueron satisfactorios. Se observó un
efecto de inhibición pobre incluso a la mayor concentración del aceite esencial estudiada. Estos
resultados preliminares hacen necesario extender el estudio utilizando concentraciones de aceite
superiores al 2% (p/p). Las bacterias Gram-negativas, como Salmonella spp., son más susceptibles al
daño en la membrana provocado por el aceite esencial de orégano, debido a un menor espesor en la
misma; en cambio, en las Gram-positivas, como Staphylococcus aureus, tomaría más tiempo para
producir la lisis celular debido a su membrana celular más gruesa.
Las películas biodegradables activas con aceite esencial de orégano pueden ser utilizadas en el campo
de la conservación de los alimentos como una tecnología de barrera orgánica eficaz asociada a otros
mecanismos de control. Estas películas biodegradables también pueden utilizarse para minimizar
tratamientos térmicos severos o la utilización de aditivos alimentarios que a concentraciones
inadecuadas pueden causar toxicidad. Es recomendable ampliar el estudio inhibitorio hacia otros
microorganismos, como los hongos, debido a que muchos alimentos son susceptibles al deterioro
fúngico. Las películas biodegradables activas pueden ser apropiadas para el envasado de productos a
base de carne y para vegetales mínimamente procesadas.
5. REFERENCIAS
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